[发明专利]用于工业规模分散的生物基质支架

说明书

优先权声明

本申请在35 U.S.C.§119(e)下要求2010年7月2日提交的、序列号为61/360,939的美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

政府支持声明

本发明的各方面在国立卫生研究院(NIH)资助号AA014243和IP30-DK065933、国立糖尿病、消化系统和肾病研究院(NIDDK)资助号DK34987、国立癌症研究院(NCI)资助号CA016086和国立牙科和颅面研究所资助号DE019569的政府支持下做出。美国政府对本发明具有一定的权利。

技术领域

本发明涉及生物基质支架和产生生物基质支架的方法，以及它们作为完整支架或作为以各种方式被切片或粉碎以及被分散以用于特定的实验和临床用途的支架在不同应用中的用途。

发明背景

先体内后体外(ex vivo)或临床项目如细胞疗法中使用分化细胞的能力取决于维持具有成体表型并具有完全功能的细胞或能够谱系限制干细胞或祖细胞(“干/祖细胞”)以实现该成体表型的能力。干细胞研究中正在进行的革命已经使得干/祖细胞群体包括来自胚胎、胎儿和出生后组织的那些的鉴定和分离成为可能¹。针对所有成体细胞类型鉴定和分离干/祖细胞的能力以及使它们扩增和分化的能力极大地增加了利用它们用于制药学及其他工业研究项目、用于学术研究以及用于临床项目诸如基于细胞的疗法和组织工程的潜能²。

目前用于先体内后体外维持分化细胞或将干细胞谱系限制为成体命运的方法是部分成功的，并且涉及将细胞铺板在或嵌入一种或多种细胞外基质成分的基质并嵌入对于所需成体表型定制的由特定激素、生长因子、和营养物组成的培养液中。对于非常原始的干细胞诸如胚胎干(ES)细胞或诱导多能干细胞(iPS)，或出生后衍生的可以转变为多种成体命运的干细胞，诸如间充质干细胞(MSC)或羊水来源干细胞(AFSC)，这些干细胞经受可溶性信号和/或细胞外基质成分的混合物，并必须经数周时间以多组这样的信号进行处理。典型地，所实现的成体表型随着每次制备是不同的，并具有某些成体特异基因的过表达或低表达和/或一种或多种成体组织特异性基因的异常调节。

细胞外基质由细胞分泌，在一个或多个细胞表面上与它们邻近，并且已经长期被理解为是对于细胞的结构支持物⁷。它是由多种生物活性分子组成的极其复杂的支架，所述生物活性分子被高度调节，并且对于决定附着细胞的形态、生长和分化是关键的⁸。培养细胞的组织特异性基因表达通过在基质提取物或纯化的基质成分上培养细胞来改善⁹。然而，个别基质成分，单独的或组合的，不能够概括组织的复杂基质化学和结构。这与下列事实相关：基质成分处于与自然组织区域以及与组织学结构诸如血管相关的梯度中。组织基质的这种复杂性更加容易通过对组织脱细胞化并留下基质作为残留物的提取法来实现^10、11。然而，当前的脱细胞化方案由于使用溶解基质成分的基质降解酶或缓冲液而导致一些基质成分的大量流失。

本发明提供了生物基质支架以及制备和使用这样的生物基质支架的方法。本发明的方法导致产生富含组织的大部分胶原并具有结合基质成分和基质结合激素、生长因子和细胞因子的组织特异性提取物，所述胶原、结合基质成分和基质结合激素、生长因子和细胞因子对成熟细胞和干/祖细胞群体的谱系限制共同地产生重复性更高且更有效的分化效果。

发明内容

本发明提供了由生物组织产生生物基质支架的方法，所述生物基质支架用于分散(例如，利用所述量，例如实施例2中所述的方案中所述的量的工业规模分散)至培养装置上的方法，其包括：a)以包含约3.5M NaCl至约4.5M NaCl的盐浓度的缓冲液灌注生物组织或使生物组织均质化；b)在第一培养液中以包含脂肪酶和/或去污剂的脱脂缓冲液灌注步骤(a)的生物组织或提取步骤(a)的匀浆，其中所述第一培养液的重量摩尔渗透压浓度是约250mOsm/kg至约350mOsm/kg，以及所述第一培养液是无血清的且处于中性pH；然后

c)用处于中性pH且包含约2.0M NaCl至约5.0M NaCl的盐浓度的缓冲液灌注步骤(b)的组织或提取步骤(b)的匀浆，选择所述浓度以保持生物组织中鉴定的胶原不溶；然后