[发明专利]生产细胞系

权利要求书

1.一种在细胞培养物中生成重组目标多肽(POI)的方法，包括遗传工程改造真核细胞系

-以在预培养阶段中专门引起G2+M细胞周期阶段延长，及

-以在预培养阶段后的生产阶段中生成POI。

2.权利要求1的方法，其中所述细胞系是在其基因组中稳定整合了用于表达细胞周期调控剂的表达盒的细胞系。

3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞系接受工程改造以调控细胞周期调节剂，优选通过特异性过表达、激活、突变、下调、删除、降解或抑制细胞周期调节剂来进行。

4.权利要求3的方法，其中所述细胞周期调节剂选自下组：Cdk/细胞周期蛋白复合物诸如细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)，G1特异性细胞周期蛋白，G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白，及其转录或降解因子，诸如Clb2，Clb1，Clb3-6，Cln1-3，Cdc6，Cdc14，Cdc20，Cdc28，Cdc48，Cdh1，Kar1，Mad2，MBF，Mcm1，Pds1，Rrp42，SBF，Sic1，Swe1，Swi5，Whi2。

5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述细胞系是野生-插件(wild-card)宿主细胞系或接受改造以生成细胞周期调控剂和所述POI的生产细胞系。

6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述POI选自下组：血清蛋白质，诸如免疫球蛋白或血清清蛋白，酶，激素，信号分子，基质蛋白质，其片段或衍生物，或介导宿主细胞代谢物生成的多肽。

7.权利要求1至6任一项的方法，其中所述细胞是真菌细胞，优选酵母细胞，诸如毕赤酵母(Pichia)属的细胞，特别是巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)菌株的细胞，或高等真核细胞，优选哺乳动物或植物细胞。

8.可通过权利要求1至7任一项的方法获得的高产生产细胞系，其具有至少0.1μg/(g·h)的比生产力q_P来生成所述POI。

9.可通过权利要求1至7任一项的方法获得的细胞系的高产生产细胞培养物，其中在占补料时间至少50%的过程时间里至少50%的细胞在G2+M阶段中。

10.权利要求9的细胞培养物，其在至少10小时的时段里处于稳态。

11.权利要求9或10的细胞培养物，其为补料-分批或连续细胞培养物。

12.权利要求9至11任一项的细胞培养物，其在工业规模具有至少0.1μg/(L.h)的体积生产力Q_P。

13.在细胞培养物中提高重组POI生产的产量的方法，包括

a)遗传工程改造真核生产细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长，

b)在预培养阶段中培养所述生产细胞系以获得G2+M细胞周期阶段延长的稳态细胞培养物，

c)在所述预培养阶段后的生产阶段中培养所述稳态细胞培养物以生成该POI，并

d)收集细胞培养物含有POI的级分。

14.在细胞培养物中延长真核生产细胞系的重组POI生产阶段的方法，包括遗传工程改造细胞系以专门引起G2+M细胞周期阶段延长。