[发明专利]一种用于从蔗糖制备1,3-丙二醇的方法

说明书

本发明涉及一种用于从蔗糖生物制备1,3-丙二醇的新方法，包括培养经遗传修饰用于生物生产1,3-丙二醇的微生物，其中所述微生物包含用于从4-羟基-2-酮丁酸产生1,3-丙二醇的两步代谢途径，其包括第一步脱羧基和第二步还原，并且其中所述微生物经修饰而能够使用蔗糖作为唯一碳源。

背景

通过培养产生1,3-丙二醇的微生物来发酵生产1,3-丙二醇是本领域中已知的。涉及维生素B12依赖性酶的1,3-丙二醇生产方法已经有叙述；这些方法使得生产工艺流程非常昂贵。

正需要可替代的解决方案以不依赖维生素B12的途径从可再生的碳源生产1,3-丙二醇。而且，正需要基于这种生产的必需能量改进被生产的产物的总得率(overall yield)。最后，正需要控制杂质和副产品的水平，用于产物分离、其销售和进一步的使用。

1,3-丙二醇主要从甘油(见专利申请PCT/EP2010/056078)和从葡萄糖经由中间物甘油产生。因为全世界的甘油储备(mondial glycerol stock)有限，因此需要发现其它的碳水化合物资源。

发酵培养基中使用的碳源一般由碳水化合物组成，所述碳水化合物大多来自于植物。淀粉是植物中最丰富的碳水化合物储备。

由于生物技术生产的大宗化学品(commodity chemicals)的成本主要与原材料的成本(即发酵底物的成本)有关，因此对于工业规模的生产而言，使用精制糖不是经济上可持续的选择。需要较廉价、保持高含量可发酵糖的底物。在这个方面，来自制糖工业的蔗糖代表了一种好的选择。

蔗糖从含糖植物，如糖用甜菜、甘蔗、甜高粱、糖枫、糖棕榈或蓝色龙舌兰(blue agaves)获得。含有制糖工艺的中间物、产物或副产物的不同蔗糖(原汁、稀汁或澄清汁、浓汁、蔗糖糖浆、纯蔗糖、糖蜜(molasses))均可用作发酵给料。

微生物中摄取和利用蔗糖的两种不同系统已经被表征。

第一种是基于磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依赖的蔗糖磷酸转移酶的系统(蔗糖PTS)，其中蔗糖被摄取并以磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)作为供体被磷酸化，产生细胞内蔗糖-6-磷酸。蔗糖-6-磷酸随后被转化酶水解成D-葡萄糖-6-磷酸和D-果糖。D-果糖进一步被ATP依赖的果糖激酶磷酸化成为D-果糖-6-磷酸，然后可以进入中心代谢。这种系统已经在数种细菌菌种，革兰氏阳性以及革兰氏阴性中被描述。在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中，超过90%的野生型克雷伯氏菌属(Klebsiella)，少于50%的埃希氏菌属(Escherichia)和少于10%的沙门氏菌属(Salmonella)菌株是蔗糖阳性的。

已经从沙门氏菌属中分离出了携带编码蔗糖PTS的scrKYABR基因的接合型质粒pUR400(Schmid等,1982,Schmid等,1988)。

最近在大肠杆菌(Escherichia coli)EC3132中发现了称作“非-PTS系统”的第二系统(Bockmann等,1992)。该系统包括编码蔗糖:质子同向转运转运系统(CscB)、果糖激酶(CscK)和蔗糖特异性阻抑物(CscR)的cscBKAR基因。

大肠杆菌K12及其衍生物不能利用蔗糖。然而，可以通过转移编码两种先前描述的系统的基因而赋予这种能力。这已经通过在大肠杆菌K12中转移质粒pUR400(Schmid等,1982)或在大肠杆菌的蔗糖阴性菌株中转移携带cscBKAR基因的不同质粒(包括pKJL101-1)(Jahreis等,2002)得到证明。关于工业应用，从蔗糖生产色氨酸已经在大肠杆菌K12中有文献报道(Tsunekawa等,1992)，生产氢已经在携带pUR400质粒的大肠杆菌中显示(Penfold和Macaskie,2004)，并且通过转移两种系统，即PTS和非PTS，生产不同氨基酸已在专利申请EP1149911中报道。

令人惊讶地，通过将导致在不能利用蔗糖的大肠杆菌菌株中利用蔗糖的遗传修饰和用于1,3-丙二醇的特异性生物合成途径组合，本发明的发明人能够获得从可再生的碳源(蔗糖)生产1,3-丙二醇的得率的改善。

发明内容

本发明涉及一种经遗传修饰、用于从蔗糖生物生产1,3-丙二醇的微生物，其中所述微生物包含：

-用于产生1,3-丙二醇的两步代谢途径，包括第一步用具有2-酮酸脱羧酶活性的酶将4-羟基-2-酮丁酸脱羧基，和第二步用具有羟基醛还原酶活性的酶还原所得的3-羟基丙醛，和

-能够使微生物利用蔗糖作为唯一碳源的基因。