[发明专利]具有提高外源基因表达活性的DNA元件

说明书

技术领域

本发明涉及转化的哺乳动物宿主细胞，其分泌外源蛋白的能力已通过利用具有DNA元件的外源基因表达载体而提高，并涉及利用宿主细胞生产外源蛋白的方法。

背景技术

由于遗传重组技术的发展，蛋白质药物产品例如治疗性蛋白和抗体药物的市场快速增长。特别是抗体药物具有高特异性，即使将其给予人体也不引起不利的免疫反应，因此，一直在对其积极进行开发。

可使用微生物、酵母、昆虫、动物或植物细胞、转基因动物或植物细胞等等，作为在其中产生由抗体药物代表的蛋白质药物的宿主细胞。为了使蛋白质药物具有生物学活性或免疫原性，翻译后修饰例如折叠或糖基化是必要的，因此不能进行复杂的翻译后修饰的微生物或具有不同聚糖结构的植物不适合作为以生物反应器操作的宿主细胞。考虑到培养的哺乳动物细胞例如来自于与人亲缘很近的物种的CHO细胞具有与人相似的聚糖结构，而且安全，并且可以使用所述细胞进行翻译后修饰，目前标准是使用这类细胞。

在将培养的哺乳动物细胞用作宿主细胞的情况中，与微生物等(见非专利文件1)相比存在生长率低、生产率低、成本高等问题。此外，为了在临床试验中使用蛋白质药物产品，有必要给予大量产品。因此，其生产能力的缺乏也是世界性难题。因此，为了提高外源基因在培养的哺乳动物细胞中的生产率，迄今已进行了启动子、增强子、药物选择标记、基因扩增和培养工程技术等等的大量研究。然而，目前的情形是尚未建立能始终如一地提高基因表达的系统。作为外源蛋白低生产率的的原因之一，考虑到“位置效应”(见非专利文件2)。当将外源基因引入宿主细胞时，其被随机地整合到宿主染色体基因组，并且外源基因的转录受到外源基因整合区域周围DNA的很大影响。然而，位置效应受到例如外源基因的插入位点、拷贝数、结构等因素的影响，非常难以控制染色体中的插入位点。

为了解决所述问题，业已鉴别了调控多核苷酸序列(也叫DNA元件)，例如基因座控制区(LCR)、支架/基质附着区(S/MAR)、绝缘子、遍在染色质开放元件(UCOE)和抗阻遏物(STAR元件)等(见非专利文件3-6)。LCR不需要在内源基因的基因座打开染色质结构。然而，LCR是转录调控元件，其具有打开外源基因被整合位点的DNA周围染色质结构的能力及当其与外源基因表达单元一起使用时重塑大范围染色质的能力，并且认为其需要富含AT的区域(见非专利文件7)。

常将LCR代表的上述DNA元件与启动子联合使用，已知与只用启动子的情况相比，在DNA元件与启动子联合使用的情况中，外源基因表达水平增加。然而，至今报道了极少DNA元件类型，并且促进外源基因表达增强的各种机制也相互不同。另外，即使DNA元件和启动子联合使用，在DNA元件和启动子控制下也不能生产足量的治疗性蛋白。因此，不能说已获得能增加外源蛋白生产率的DNA元件的充足知识。

因此，本发明目标是提供增加在蛋白质药物产品中待用的外源蛋白产量的方法，所述方法使用具有在宿主细胞例如培养的哺乳动物细胞中提高外源基因表达的高活性的DNA元件。

引文列表

非专利文献

NPL 1: Florian M. Wurm. (2004) Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells (在培养哺乳动物细胞中生产重组蛋白治疗药物). Nat. Biotechnol. 22(11): 1393-1398

NPL 2: Ted H. J. Kwaks和Arie P. Otte. (2006) Employing epigenetics to augment the expression of therapeutic proteins in mammalian cells (采用表观遗传学来增加哺乳动物细胞中治疗性蛋白的表达). TRENDS in Biotechnol. 24(3): 137-142

NPL 3: Pierre-Alain Girod, Duc-Quang Nguyen.等(2007) Genome-wide prediction of matrix attachment regions that increase gene expression in mammalian cells (在哺乳动物细胞中增加基因表达的基质附着区的基因组范围预测). Nat. Methods. 4(9): 747-753