[发明专利]在细胞培养物中生产重组高分子量vWF的方法

权利要求书

1.一种用于生产重组Von Willebrand因子(rVWF)组合物的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)提供基础细胞培养基；

(b)给所述基础细胞培养基补充铜，以提供至少2.4μg/L的最终铜浓度；

(c)提供一个或多个细胞，所述一个或多个细胞包含编码rVWF蛋白的核酸；

(d)在补充了铜的细胞培养基中培养所述一个或多个细胞，使得所述细胞表达rVWF并将其分泌进培养物上清液中；和

(e)回收所述培养物上清液的至少一部分，

其中所述回收的上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少30mU/μg rVWF。

2.根据权利要求1所述的方法，其另外包括下述步骤：在培养所述一个或多个细胞之前，用水解物补充所述基础细胞培养基。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述水解物是植物水解物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述水解物是大豆水解物。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是不含动物蛋白的培养基。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是不含蛋白的培养基。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是化学成分确定的培养基。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述补充铜的基础细胞培养基的最终铜浓度是至少4μg/L铜。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述补充铜的基础细胞培养基的最终铜浓度是2.4μg/L至20μg/L铜。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中补充所述基础细胞培养基的铜以铜盐、铜螯合物或它们的组合的形式提供。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述铜盐选自：硫酸铜、醋酸铜、碳酸铜、氯化铜、氢氧化铜、硝酸铜和氧化铜。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述一个或多个细胞是哺乳动物细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中培养所述一个或多个细胞包括：所述细胞的分批培养。

15.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中培养所述一个或多个细胞包括：所述细胞的连续培养。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞的连续培养以恒化模式进行。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞的连续培养以灌注模式进行。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在至少100L所述经补充的基础细胞培养基中培养所述一个或多个细胞。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在培养所述一个或多个细胞的步骤过程中，将细胞密度维持在小于2.5x10⁶个细胞/mL。

20.根据权利要求19所述的方法，其中在培养所述一个或多个细胞的步骤过程中，将所述细胞密度维持在小于2.0x10⁶个细胞/mL。

21.根据权利要求19所述的方法，其中在培养所述一个或多个细胞的步骤过程中，将所述细胞密度维持在小于1.5x10⁶个细胞/mL。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述回收培养物上清液的至少一部分的步骤包括过滤或离心，以从培养物上清液的所述部分中除去细胞。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述回收的上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少40mU/μg rVWF。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述回收的上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少50mU/μg rVWF。