[发明专利]分析物的分离

说明书

技术领域

本发明涉及用于分离材料的设备和方法，且更具体地涉及使用高压液相色谱（HPLC）进行分析物的基于尺寸的分离。

发明背景

色谱方法通常通过将混合物溶解到流动相内并使流动相经过固定相来将混合物分离成其组成成分。分离通过混合物的成分在流动相与固定相之间的差异性分开来实现。分析物的混合物可通过利用分析物的固有特性，诸如极性、电荷、功能和大小而色谱分离成离散亚群。

各种色谱方法对于基于尺寸的分析物分离是已知的。最常见的方法利用填充有固体相的钢柱，固体相由二氧化硅或聚合物的球形颗粒组成，球形颗粒的直径通常在约4至17微米范围内。球形颗粒具有变化尺寸的孔。当流动相经过特定固定相时，分析物根据分析物的尺寸以及各孔的尺寸进入各孔。较小的分析物进入比较大分析物更多的孔，且因此往往在柱内驻留更长时间。因此，柱的流出物中较大分析物的浓度往往在过程开始时最大，而流出物中较小分析物的浓度往往在过程稍后时间最大。

基于尺寸的色谱方法包括尺寸排阻色谱法（SEC）、凝胶过滤色谱法（GFC）以及凝胶渗透色谱法（GPC）。尽管这些方法使用广泛，但它们也并非没有缺点。

第一个缺点是色谱柱中的微粒固定相可用作过滤器。某些大分析物可能根本不穿过柱，且因此不被探测到。

第二个缺点是利用色谱柱的分离往往较慢。分离和柱重新平衡通常需要60分钟或更久。理论上，可通过增加流动相的流率来缩短分离时间。但是，最多可缩短适当量的分离时间，因为增加流率会增加固定相上的压力，且增加的压力会压缩多孔颗粒，损坏柱的分离能力。

第三个缺点在于当暴露于具有碱性pH（即大于8的PH）的液体时，基于二氧化硅的固定相中的颗粒开始溶解。另一方面，尽管基于聚合物的固定相可容易地适应更大的PH范围，但某些分析物会被基于聚合物的颗粒吸收。一些分析物和聚合物颗粒的相互亲和性为分离过程引入另外的区分性能，且该过程变为混合模式过程，不再仅基于分析物的大小。

毛细管动力学分级法（CHF）是另一种基于尺寸的分离技术。在CHF中，液体流过长而窄的毛细管。流过毛细管的速度分布是大致抛物线形的（泊肃叶流动）。液体的速度在毛细管中心处最大，并朝向毛细管壁减小，在毛细管壁处液体几乎停滞。注入毛细管内的分析物散布整个毛细管的孔，并经历所有可能的流率。在任何给定时刻，分析物颗粒以最接近其流体动力学中心的流率移动。分析物颗粒的流体动力学中心到毛细管壁的最近路径大致等于颗粒的流体动力学半径。因此较小的分析物会比较大的分析物更靠近毛细管壁，且更靠近毛细管壁时它们的运动受到与毛细管壁相邻的较低液体流率的影响。于是，较大的分析物保持在毛细管内较高流率的附近，并具有比较小分析物高的平均速度。因此较大的分析物首先被洗提并与较小分析物分离。

由于可实现快速分离时间（例如7-10分钟），所以CHF中缺少颗粒固定相是有利的。但是，CHF技术具有差的分辨率且主要应用于胶体的分离。此外，非常窄的毛细孔（通常具有范围从约1至约10微米的直径）使得难以探测分析物。

CHF尚未发现在诸如蛋白质的生物分子分离中的显著应用，生物分子通常具有比CHF中约0.015至1微米的典型分离范围小的尺寸。

流体动力色谱法（HDC）是基于尺寸的分离技术，该技术包括GPC和CHF两者的元素。HDC利用如GPC中包含颗粒固体相的管状柱。但是，不像GPC中的固体相颗粒，HDC中的颗粒固体相是非多孔的。非多孔颗粒形成液体流动相可到达的间隙空间的网络。间隙空间用于模拟CHF中存在的长毛细管。如CHF中那样，由于沿柱的壁和沿形成间隙空间的非多孔颗粒的表面的泊肃叶流动，在HDC中基于其平均速度分离分析物。

用于HDC的典型分离范围为约0.01-10微米，且主要限制了用于亚微米级的胶体颗粒分析的技术。HDC具有许多与GPC相同的缺点，包括长的分析时间和由于高压可能造成的柱损坏。