[发明专利]利用逆转录定量实时PCR(RT-qPCR)技术检测、区分和定量T细胞群体的方法

说明书

本发明涉及用于检测、区分和定量T细胞群体的方法，包括下述步骤：a)使第一等份的个体体液与至少一种抗原接触，其中所述体液含有抗原呈递细胞(APC)和T细胞，b)将所述第一等份与至少一种抗原温育一段确定的时间，c)通过利用逆转录定量实时聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测所述第一等份中以及未与所述至少一种抗原温育过的第二等份的个体体液中由特定T细胞群体中的T细胞诱导的至少第一种APC标志物来检测和区分T细胞群体，和d)通过确定检测到的第一等份的APC标志物与第二等份的比例来检测和定量T细胞群体；还涉及用于实施该方法的试剂盒。

T细胞通过协调免疫应答以及藉由多种直接和间接效应物功能控制和消灭病原体和肿瘤细胞，在抗微生物感染和肿瘤疾病的免疫防御复杂网络中扮演关键角色。对复杂的T细胞功能的干扰可能导致自身攻击性T细胞的错误活化，同时引发严重的自身免疫病如多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)和青少年糖尿病(I型糖尿病)。

理论上，T细胞在表型上呈现很大的异质性以及广谱的效应物功能。因此，基于表面蛋白CD4和CD8的表达，可以将T细胞大致分类为CD4阳性T细胞(T辅助细胞(Th))和CD8阳性细胞毒T细胞(CTL)。

CD4⁺T细胞在免疫防御的活化、极化(polarization)和协调中扮演关键角色。CD4⁺T细胞由于它们的T细胞受体与位于抗原呈递细胞(APC)表面上的加载有肽的II类MHC分子的特异性相互作用而被活化，随后藉由细胞-细胞接触和/或各种信使分子(例如细胞因子、趋化因子)的分泌来控制B细胞的抗体产生(免疫应答的体液分支)以及CTL的活化(免疫应答的细胞分支)。

基于特征性表面蛋白的表达和标志物细胞因子的产生，可以将CD4⁺T细胞细分为T辅助细胞1(Th-1)、T辅助细胞2(Th-2)、和T辅助细胞17(Th-17)。Th-1细胞以细胞因子IFN-γ与TNF-α的产生以及转录因子T-bet的表达为特征。Th-1细胞通过刺激巨噬细胞、CD4^-CD8⁺细胞毒性T细胞、CD4⁺CD8⁺细胞毒性T细胞、以及天然杀伤细胞(NK细胞)和NKT细胞的活化和分化来支持高效的细胞介导免疫应答的发动。Th-2以细胞因子IL-4、IL-5、IL6、IL-10和IL-13的分泌以及转录因子GATA-3的产生为特征，并且支持B细胞中抗体(免疫系统的体液分支)的产生以及类别改变。Th-17细胞以细胞因子IL-17、TNF-α、GM-CSF和IL-6的产生为特征，且似乎在风湿性自身免疫病中起关键作用。除了Th-1、Th-2和Th-17细胞之外另一种CD4⁺T细胞群体被定义为调节性T细胞，其在免疫应答的弱化、口服免疫耐受以及自身免疫病的预防中起重要作用。调节性T细胞可细分为CD4⁺CD25⁺CTLA4⁺天然调节性T细胞(T-reg)以及Th-3和Tr-1细胞，后两者以细胞因子TGF-β(Th-3细胞)或IL-10(Tr-1细胞)的产生为特征。

在与感染了微生物和寄生物的细胞和组织以及肿瘤细胞的对抗中，CTL通过直接效应物机制，诸如释放细胞毒性物质(例如穿孔蛋白、颗粒酶)和触发凋亡来破坏所述细胞和组织，从而起关键作用。此外，通过分泌免疫刺激性细胞因子(IFN-γ,TNF-α,IL-15)和趋化因子(MIP1α,MIP1β,Rantes)以及多种可溶性抗病毒因子(IFN-α,IFN-β,IFN-δ,CAF)，CTL表现更多的，在某种程度上说非常特异性的效应物功能，此类功能非常高效地有助于对病原体复制和扩散的限制。此外，其他细胞毒性T细胞群体已经得到描述，此类群体展现CD4⁺CD8⁺表型(CD4⁺CD8^暗,CD4^暗CD8^亮或CD4^hiCD8^hi)。

因此，T细胞是获得性免疫系统防止和控制微生物，尤其是病毒诱导的疾病，以及识别和破坏肿瘤细胞的一种重要的保护性机制。