[发明专利]一种微波驱动的杯状病毒RNA聚合酶的RNA聚合反应

权利要求书

1.一种以单链多核苷酸为模板合成互补RNA链的方法，所述方法包括以下步骤：

采用有效量的微波能量对含有所述模板以及一种杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反应条件下并在引物存在或缺席的条件下进行辐照，所述引物与所述模板杂交，其附加条件为，如果所述模板含有脱氧核糖核苷酸，该辐照在修饰的GTP，优选2’-氟代-GTP或α-硫代-GTP存在的条件下进行，以及，如果所述模板含有的脱氧核糖核苷酸在其3’端具有非脱氧-C核苷酸时，该辐照步骤在引物存在的条件下进行，所述引物与所述模板杂交，另一附加条件为，如果所述模板分别是聚腺苷酸，聚鸟苷酸或聚尿苷酸RNA或分别是polyA,polyG或polyU RNA，该辐照步骤在引物存在的条件下进行，所述引物与所述模板杂交，以及如果所述模板是聚胞苷酸，所述辐照步骤在引物缺席的条件下进行，所述混合物含有的GTP分别相对ATP,CTP和UTP过量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是一种诺瓦克病毒，沙波病毒，水泡病毒或兔病毒的RNA聚合酶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是一种诺瓦克病毒HuCV/NL/Dresden174/1997/GE株(GenBank Acc.No AY741811)的RNA聚合酶，或沙波病毒pJG-Sap01株(GenBank Acc.No AY694184)的RNA聚合酶，或水泡病毒FCV/Dresden/2006/GE株(GenBank Acc.No DQ424892)的RNA聚合酶，或兔病毒pJG-RHDV-DD06株(GenBank Acc.No.EF363035.1)的RNA聚合酶。

4.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶具有选自由SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14组成的组中的氨基酸序列。

5.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述混合物采用频率为1500MHz-3500MHz以及功率为50-1000W的微波进行辐照。

6.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述混合物采用微波辐照3s-120s。

7.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述混合物含有至少一种修饰的或标记的核糖核苷酸，可选地除了修饰GTP，优选2’-氟代-GTP或α-硫代-GTP。

8.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述模板是单链RNA，单链DNA，混合单链DNA/RNA或其混合剂。

9.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述模板具有15-30个核苷酸的长度，优选为21-28个核苷酸，更优选为21-23个核苷酸，并且所述辐照步骤在引物缺席的条件下进行。

10.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述模板的3’端具有至少一个C核苷酸，优选1-5个C核苷酸。

11.根据权利要求1-9中的任意一项所述的方法，其特征在于，在RNA聚合反应条件下进行辐照步骤之前，所述含有模板和杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物首先采用有效量的微波能量在rCTP作为唯一核苷酸存在的条件下进行辐照。

12.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶在微波辐照下将所述双链产物分离成单链，合成与各单链互补的RNA链，可选地在引物存在的条件下，并重复分离互补链和RNA合成步骤一次或多次，可选地在引物存在的条件下。

13.一种将一个或多个核糖核苷酸转移至单链多核苷酸模板的3’端的方法，所述方法包括：采用有效量的微波能量对含有杯状病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP或rGTP或rUTP或rCTP或其修饰的或标记的类似物存在的条件下进行辐照。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述模板是单链RNA，单链DNA，混合单链DNA/RNA或其混合剂。