[发明专利]制造病毒载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制造病毒载体的方法和用于制造病毒载体的培养基。

 

发明背景

已经开发了使用病毒载体的基因疗法用于治疗癌症和传染病以及先天的遗传性疾病，并已进行了许多临床试验。特别地，对于使用反转录病毒载体或腺病毒载体的基因疗法已经进行了许多尝试。

用于制造重组反转录病毒载体（其用于整合所需基因）的转移载体的实例包括衍生自野生莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV）的pLXSN（Genbank Accession M28248）和pMFG，其中从该基因组中取出病毒粒子结构蛋白基因（gag、pol、env）。此外，进一步改性的载体用于人类临床试验。

重组反转录病毒载体通过以下方法制造：用DNA载体转染包装细胞（Psi-Crip、GP+E86、GP+envAm12、PG13等等），其中插入所需基因以诱发病毒生产细胞，培养该病毒生产细胞，并随后收获含有所需病毒载体的上清液。随后，包装细胞可以用上清液再次感染，并且可以从感染的细胞中选择能够稳定制造用于表达所需基因的反转录病毒载体的生产细胞的克隆。通过此类方法，制备主细胞库（MCB）并随后制备工作细胞库，并由此稳定地制造用于基因疗法的重组反转录病毒载体。

反转录病毒生产细胞的培养对提高由反转录病毒生产细胞制得的病毒的效价是非常重要的。换句话说，需要检查达到更高的病毒效价的培养条件。目前已知的提高病毒效价的方法包括多重感染（例如非专利文献1），或添加丁酸钠或曲古霉素A（其为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂）（例如非专利文献2和3）。但是，这些已知方法不能产生显著的效果。

 

引文列表

非专利文献

非专利文献1：J. Hum. Gene Ther., 第6卷, 第1195-1202页（1995）

非专利文献2：-Gene Therapy, 第3卷, 第756-760页（1996）

非专利文献3：BioTechniques, 第29卷, 第884-890页（2000）

发明概述

技术问题

本发明的目标是开发一种用于制造病毒载体的培养基，特别是用于培养可以保持更高病毒效价的病毒生产细胞的培养基，并提供制造病毒载体的方法，其包括使用所述培养基，以及制造转化细胞群体的方法，其包括使用通过制造病毒载体的方法制得的病毒载体。

 

问题的解决方案

本发明人进行了深入研究以解决上述问题，结果发现，当使用含有视黄酸和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂作为活性成分的培养基培养病毒生产细胞时，提高的病毒生产可以持续很长一段时间并获得具有令人惊讶的高病毒效价的病毒上清液。

具体而言，本发明涉及：

[1]制造病毒载体的方法，包括在含有视黄酸和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂作为活性成分的培养基中培养能够制造所述病毒载体的细胞的步骤；

[2]根据上文[1]的方法，其中所述培养基进一步含有脂质作为活性成分；

[3]根据上文[1]或[2]的方法，其中所述细胞是能够连续制造所述病毒载体的细胞；

[4]根据上文[1]至[3]任一项的方法，其中所述病毒载体是反转录病毒载体；

[5]根据上文[1]至[4]任一项的方法，其中所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是选自曲古霉素A和丁酸钠的至少一种物质；

[6]通过根据上文[1]至[5]任一项的方法制得的病毒载体；

[7]制造转化细胞群体的方法，包括用根据上文[6]的病毒载体转化细胞；

[8]通过根据上文[7]的方法获得的转化细胞群体；

[9]用于药物的根据上文[8]的细胞群体；

[10]用于制造药物的根据上文[8]的细胞群体；

[11]含有根据上文[8]的细胞群体作为活性成分的药物组合物；

[12]治疗或预防疾病的方法，其包括向对象施用有效量的根据上文[11]的药物组合物；和

[13]用于制造病毒载体的培养基，含有视黄酸和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂作为活性成分。

 

发明效果

根据本发明的制造病毒载体的方法，与常规方法相比，病毒生产可以持续很长一段时间，并可以获得高病毒效价。因此，根据本发明的方法，可以通过一轮培养准备收集大量病毒。此外，由本发明的培养基中培养的病毒生产细胞所制备的病毒载体具有高病毒效价，并因此表现出比通过常规方法获得的病毒载体更高的基因转导效率。