[发明专利]在流式芯片检定中对核酸目标的实时扩增和微阵列检测

权利要求书

1.一种对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行实时扩增和检测的方法，包括以下步骤：

a）提供流式芯片装置，包括：

-流动通道，其截面在0.01～10mm²之间且容积为V1，其中所述流动通道被配置成使得引入所述流动通道中的溶液经由所述流动通道而循环；

-检测室，其与所述流动通道流体连通，所述检测室具有光学透明的固体支持物以及包括多于4种固定在所述透明固体支持物的表面的局部区域中的捕捉分子的微阵列，其中所述检测室的高度低于1mm且容积为V2，且其中V2/V1比率在0.001与0.5之间；

-至少2个、优选3个温度被调控的不同温度区，各个温度区位于所述流动通道的不同位置，其中一个温度区包括所述检测室并且具有使所述目标多核苷酸分子杂交到所述捕捉分子的温度；

b）将体积为V3且含有目标多核苷酸分子的溶液引入到所述流动通道和用于多核苷酸分子扩增的试剂中，其中V3/（V1+V2）比率高于0.02且低于1；

c）将所述溶液进行至少5个扩增循环，以获得标记的目标多核苷酸分子，其中通过使所述溶液经所述流动通道和相同的检测室在不同温度区之间循环，从而得到一个扩增循环，其中一个扩增循环进行少于3分钟；

d）通过检测从具有杂交的目标多核苷酸的表面的局部区域发出且在通过光束使荧光染料激发之后测量到的荧光，从而在至少3个、优选为至少5个不同的扩增循环中从杂交的目标多核苷酸分子测量不同扩增时点的荧光信号；

e）分析从所述局部区域得到的信号值，以对存在于所述样品中的目标多核苷酸分子进行检测和/或定量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增循环进行少于2分钟，优选少于1分钟。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测室具有选自椭圆形、卵形、长斜方形、六边形、八边形、菱形的形状。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中体积V1+V2+V3包括气相和液相两种相。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中V2/V1比率在0.01和0.1之间。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中V3/（V1+V2）比率高于0.5，优选高于0.75，甚至高于0.9，并且低于1。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于测量荧光信号的不同扩增时点与扩增循环对应。

8.根据权利要求7所述的方法，其中通过流式芯片传感器的数据分析来确定扩增循环。

9.根据权利要求7所述的方法，其中从所述流式芯片装置特征的V1+V2以及流速来计算扩增循环。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过包括变性、退火和延伸步骤的PCR来获得扩增。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记的目标多核苷酸分子通过引入荧光染料标记的扩增前体而被荧光标记。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对从具有杂交的目标多核苷酸的表面的局部区域发出的荧光进行检测是以观测角通过承载有固定的捕捉分子的光学透明固体支持物来进行检定的，其中所述观测角在禁止角内。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕捉分子具有长至少6.8nm且优选为至少20个核苷酸并优选为多于40个核苷酸长度的序列的间隔物。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微阵列包括荧光标记的捕捉分子，与循环1相比，其在扩增的循环35中保持多于50%的荧光、优选多于80%的荧光、甚至更好为多于90%的荧光。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在气相中对来自所述杂交的目标多核苷酸分子的荧光信号进行测量。

16.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中在含有所述标记的目标多核苷酸分子的扩增溶液的存在下，对来自所述杂交的目标多核苷酸分子的荧光信号进行测量。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述检测室的检测部中的液体的高度优选在10和250μm之间，优选在50和150μm之间。