[发明专利]利用双重标记固定化探针的固相中的靶核酸序列检测

权利要求书

1.一种在固相利用对DNA聚合酶的引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性的双重标记探针，从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(a)，将上述靶核酸序列与固定化探针进行杂交；上述固定化探针具有与上述靶核酸序列互补的核苷酸序列；通过3’-末端在固相基质上进行固定化的上述探针具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记；上述相互作用性双重标记位于上述固定化探针，用于诱导上述报道分子及上述猝灭分子间的能量猝灭；第一标记及第二标记选自上述报道分子及上述猝灭分子；上述第一标记与上述固定化探针的5’-末端的磷酸基相结合，上述第二标记与位于上述第一标记的下游的胸腺嘧啶核苷的胸腺嘧啶相结合，这种上述第二标记的结合使上述胸腺嘧啶核苷对上述DNA聚合酶的引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性具有抵抗性；

步骤(b)，在切割上述固定化探针的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶相接触；与上述靶核酸序列互补的上述固定化探针通过上述DNA聚合酶的外切核酸切割反应被切割，使得上述第一标记从上述固定化探针分离，来引起在上述固相基质上的信号变化；

步骤(c)，在标有上述第二标记的上述胸腺嘧啶核苷中结束上述DNA聚合酶的上述外切核酸切割反应；

其中上述外切核酸切割反应的结束被具有与上述第二标记相结合的胸腺嘧啶的上述胸腺嘧啶核苷的抵抗性诱导，

其中所述第二标记与胸腺嘧啶的结合给所述胸腺嘧啶与所述第二标记相结合的胸腺嘧啶核苷赋予对DNA聚合酶的引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性，

其中上述第二标记残留于上述固相基质上；以及

步骤(d)，对上述固相基质上的信号变化进行检测；通过上述固定化探针的上述切割而引起的上述信号变化表示上述靶核酸序列的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

上述第一标记为猝灭分子；

上述第二标记为报道分子。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

上述第一标记为报道分子；

上述第二标记为猝灭分子。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二标记通过被引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性切割的固定化探针上的切割位点，从上述第一标记分离。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二标记位于从上述第一标记隔开2～20核苷酸的位点。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二标记位于从上述第一标记隔开4～15核苷酸的位点。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括反复进行上述步骤(a)～步骤(b)或者步骤(a)～步骤(c)的步骤，并在反复循环之间具有变性过程。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(d)的上述检测以实时方式、终点方式或预定时间间隔方式实施。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具有上述引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的上述DNA聚合酶是具有引物-独立性5’→3’外切核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)中还包含反向引物，上述反向引物用于生成与上述固定化探针进行杂交的上述靶核酸序列的拷贝。