[发明专利]基于SIRPA表达富集源自多能干细胞的心肌祖细胞和心肌细胞的方法

权利要求书

1.富集细胞群的心肌细胞和心肌祖细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供细胞群，待从所述细胞群中分离心肌细胞和心肌祖细胞；和

(b)从群中分离表达SIRPA的细胞；

其中细胞群包含被诱导分化为心肌细胞和心肌祖细胞的人多能干细胞群。

2.权利要求1的方法，其中人多能干细胞为胚胎干细胞。

3.权利要求1的方法，其中人多能干细胞为诱导多能干细胞。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中将人多能干细胞暴露于一定量的至少一种有效诱导细胞分化的诱导剂。

5.权利要求4的方法，其中基于群中的SIRPA浓度优化至少一种诱导剂的量。

6.权利要求4和5中任一项的方法，其中至少一种诱导剂包含细胞因子。

7.权利要求4-6中任一项的方法，其中至少一种诱导剂包含激活素A，优选地所述激活素A浓度为至多40ng/ml，更优选地所述激活素A浓度为约6ng/ml或约30ng/ml。

8.权利要求4-7中任一项的方法，其中至少一种诱导剂包含骨形态发生蛋白4，优选地所述骨形态发生蛋白4浓度为至多40ng/ml，更优选地所述骨形态发生蛋白4浓度为约10ng/ml。

9.权利要求4-8中任一项的方法，其中还将人多能干细胞暴露于骨形态发生蛋白抑制剂。

10.权利要求9的方法，其中骨形态发生蛋白抑制剂选自由Dorsomorphin、Noggin和可溶性骨形态发生蛋白受体所组成的组。

11.权利要求4-10中任一项的方法，其中还将人多能干细胞暴露于VEGF、DKK和bFGF中的至少一种。

12.权利要求4-11中任一项的方法，其中将人多能干细胞暴露于诱导剂介于约1天和约5天之间，优选地约3天。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中在开始诱导人多能干细胞和分离表达SIRPA的细胞之间的时间为介于约5天和约45天之间，优选地介于约8天和约25天之间。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中在细胞开始表达SIRPA后分离表达SIRPA的细胞，所述细胞开始表达SIRPA出现在细胞开始表达Nkx2.5的时间附近。

15.权利要求1-13中任一项的方法，其中在细胞开始表达Nkx2.5的时间和细胞开始收缩和表达心脏特异性结构蛋白的时间之间分离具有SIRPA细胞表面抗原的细胞。

16.权利要求1-15中任一项的方法，还包括从群体中去除表达CD90，CD31，CD140B和CD49A中的至少一种的细胞。

17.权利要求16的方法，其中使用相应的抗体去除表达CD90，CD31，CD140B和CD49A中的一种的细胞。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中使用SIRPA特异性配体分离表达SIRPA的细胞。

19.权利要求18的方法，其中使用抗SIRPA抗体或抗体片段，或抗体样分子，优选抗SIRPA抗体分离表达SIRPA的细胞。

20.权利要求18或19的方法，其中使用磁珠分离表达SIRPA的细胞。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中使用流式细胞术分离表达SIRPA的细胞。

22.权利要求1-17中任一项的方法，其中群体中的细胞包含与SIRPA基因座的调节控制元件有效连接的报告基因，其中报告基因在表达SIRPA的细胞中表达，并且分离表达SIRPA的细胞的步骤包括分离表达报告基因的细胞。

23.权利要求22的方法，其中报告基因赋予对细胞毒性剂的抗性。

24.权利要求22的方法，其中报告基因是细胞表面标签。

25.权利要求1-24中任一项的方法，其中经富集的细胞群包含至少60％，优选至少90％，更优选98％的心肌细胞和心肌祖细胞。

26.使用权利要求1-24中任一种的方法得到的经富集的心肌细胞和心肌祖细胞的细胞群。