[发明专利]单一单元离子交换色谱抗体纯化

说明书

本发明涉及单一单元纯化抗体的方法以及可以用在该方法中的装置。

用于医药应用的由细胞培养物生产的单克隆抗体的纯化是包含大量步骤的过程。这种抗体必然要摆脱所有潜在有害的污染物，诸如源自生产这些抗体的细胞的蛋白质和DNA、培养基组分诸如胰岛素、PEG醚类和消泡剂以及任何可能存在的感染试剂如病毒和朊病毒。

从生产这些蛋白质的细胞的培养物中纯化抗体的典型过程在BioPharm International Jun1，2005，“Downstream Processing of Monoclonal Antibodies：from High Dilution to High Purity”中有所描述。

因为抗体由诸如为杂交瘤细胞或转化宿主细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤衍生的NS0细胞、幼年仓鼠肾细胞、人类视网膜衍生的细胞)的细胞产生，所以必须从细胞培养液中优选在纯化过程初期去除颗粒状细胞材料。该过程的这个部分在本文中被称为“澄清”。随后或者作为澄清步骤的一部分，抗体被粗略纯化至至少约80％，通常是通过“结合加洗脱”色谱步骤(在IgG的情况下通常使用固定的蛋白质A)。这个在本文中被称为“捕集”的步骤不仅导致抗体的初期大幅纯化，还可以导致体积大幅下降，因而产物浓缩。用于捕集的其他替代方法例如为膨胀床吸附(EBA)、2-相液体分离(利用例如聚乙二醇)或采用易溶盐(lyotropic salt，诸如硫酸铵)的分级沉淀。

澄清和捕集之后，对抗体进行进一步纯化。通常，为了充分去除残余杂质，在捕集之后需要至少2个色谱步骤。捕集之后的色谱步骤通常被称为中间纯化步骤，而最终的色谱步骤通常被称为精提纯(polishing)步骤。这些步骤中的每一个通常以间歇模式作为单一单元操作进行，并且这些步骤中的至少一个以“结合加洗脱”模式进行。此外，每一个色谱步骤都需要特定的负载条件，例如pH、电导率等等。因此，为了将负载调节至所需要的条件，在每个色谱步骤之前必须进行额外的处理。上述所有这些使得该过程耗时耗力。在这些步骤中通常被基本去除的杂质都是过程衍生污染物，诸如宿主细胞蛋白质、宿主细胞核酸、培养基组分(如果存在)、蛋白质A(如果存在)、内毒素(如果存在)和微生物(如果存在)。目前的专利出版物中已经描述了许多这样纯化抗体的方法。

WO 2010/062244.该发明涉及用于分离和纯化蛋白(如单克隆抗体)的双水相萃取加强的沉淀方法。对于随后的进一步纯化抗体，描述了两种备选方案：(1)以结合和洗脱的方式的阳离子交换色谱，然后以流经模式的阴离子交换，或(2)首先是以流经模式的多模式色谱，然后是以流经模式的阴离子交换色谱。

WO 2010/048183.该发明涉及通过在酸性pH下连续的离子交换和HIC色谱从抗体中去除HCP。

WO 2009/138484.首先从说明书和权利要求书中阅读该发明并不明确。它涉及通过在蛋白质A(衍生物)柱上捕集抗体并随后从该柱释放抗体来从混合物中纯化抗体。这种后者含抗体材料能够通过例如连续的阴离子色谱和阳离子色谱来进一步纯化。

EP 2027921该发明涉及基于聚合物伯胺的膜离子交换色谱的介质，以及其在诸如抗体的纯化中的使用。

WO 2005/044856涉及使用羟基磷灰石树脂(任选地结合阴离子交换色谱)从抗体制剂中去除高分子量聚集体。

WO2008/145351描述了均以流经模式的相继的阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。

上述方法的缺点是操作时间长、可变成本高(例如由于在“结合加洗脱”步骤本身所必然需要的大的柱容量，因此需要大量昂贵的树脂)和固定成本高(由于劳动力成本)。

根据本发明的一个实施方式，通过使用均采用流经模式并且优选地作为单一单元操作的串联、联机的阴离子交换色谱(AEX)和阳离子交换色谱(CEX)，能够实现从细胞培养物产生的抗体中非常有效地去除残留杂质。因此，在AEX色谱步骤后和CEX色谱步骤前，合适的缓冲液的联机混合用于调节对于CEX色谱的关于pH和电导率的适合条件。

根据本发明的另一个实施方式，通过使用均采用流经模式并且优选地作为单一单元操作的串联、联机的阳离子交换色谱(CEX)和阴离子交换色谱(AEX)，能够实现从细胞培养基产生的抗体中非常有效地去除残留杂质。因此，在CEX色谱步骤后和AEX色谱步骤前，合适的缓冲液的联机混合用于调节对于AEX色谱的关于pH和电导率的适合条件。