[发明专利]控制细胞与基质结合的方法

说明书

背景技术

本发明涉及用于促进细胞黏附基质的方法，所述基质对于这些细胞通常无亲和性或仅有低亲和性。本发明还涉及使用非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀(Blebbistatin)和至少一个表面包被有与所述表面无亲和性或仅低亲和性的细胞的装置。

现有技术

目前使用的大部分治疗型细胞(包括成人干细胞)以锚定/附着依赖性方式增殖，这也适用于可能的替代方式，例如胚胎干细胞和诱导性多能干细胞(iPS)。但是，所述增殖方式与规模和经济上的严重限制有内在关联。对于细胞扩增而言，细胞通常被接种至平面上，它们在数小时内附着于所述平面，增殖，并通过蛋白水解酶和/或移除钙来收获。附着不是均一过程，而是出现在特定的区域，即所谓黏着斑区域。一旦附着，细胞便通过内部马达蛋白施加张力。从而，细胞骨架变得有序且在多种过程中行使功能，包括运输、支架和细胞存活。细胞脱落后，这些随着马达蛋白建立的内部张力变化而快速收缩，而先前有序的内部结构(细胞骨架和其它)则受到扰乱。若无法再附着至表面，所述细胞则会启动称为附着依赖性凋亡/失巢凋亡的细胞死亡程序。

US-A-20100009442描述了Rho相关卷曲激酶(ROCK)的抑制剂(例如Y-27632、H-1152或法舒地尔(Fasudil)),其是Rho GTP酶的效应分子且已知控制血管收缩和神经轴突延伸，可以用作凋亡/失巢凋亡抑制剂，从而促进多能干细胞，特别是胚胎干细胞的存活和/或增殖速率。ROCK抑制剂存在时，干细胞能在亚克隆或传代之前和/或之后培养而不添加饲养细胞和/或血清。

负责产生细胞张力的主要细胞骨架马达蛋白是非肌肉型肌球蛋白II(称为肌球蛋白II)。Straight等(2003)鉴定了非肌肉型肌球蛋白II的特定小分子抑制剂，以试图详细分析胞浆移动。该高度活性的小分子抑制细胞起泡，称作“布雷他汀(Blebbistatin)”。该化合物可透过细胞，良性，并且重要的是容易可逆。

Walker等(2010)公开了布雷他汀用于增强人多能干细胞(包括人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞)存活的应用。用布雷他汀处理提高人多能干细胞在克隆密度和悬浮条件下的存活率。此外，布雷他汀与合成基质联用可支持所述干细胞自我更新的确定环境。

US-A-20100216181描述使用布雷他汀或ROCK抑制剂作为存活因子，在不含血清和饲养细胞的培养基中培养多能干细胞。这里，通过在旋转瓶或生物反应器内培养细胞来生成大量细胞。

大量的附着依赖性细胞可以在生物反应器内或微载体(例如，珠)上产生，当所述细胞在悬浮条件下培养时，所述微载体可增加能使细胞得以生长的表面积。例如，从US-A-20100093083已知用于大量生产干细胞(包括多能和胚胎干细胞)的方法。本文中，所述细胞培养在内含多种微载体的无血清培养基中。所述细胞能够附着至所述微载体，并在控制条件下于生物反应器内扩增。所述培养基可额外补充有促进所述干细胞增殖和存活或防止分化的成分，例如，GSK3酶或MEK酶抑制剂。扩增后，使用酶促或非酶促细胞解离试剂从所述微载体上分离所述细胞。但是，该方法的缺点在于，只能使用对细胞具有充足亲和性的微载体。

发明内容

本发明的一个目标在于，提供用于促进细胞黏附基质的方法，这些细胞对所述基质通常无亲和性或仅有低亲和性。

该目标通过一种方法解决，其中，由向所述细胞供给所述非肌肉型肌球蛋白II抑制剂布雷他汀来促进所述细胞对所述基质的黏附，从而使所述细胞能够附着对其不具足够亲和性的表面。令人吃惊的是，向所述细胞供给所述抑制剂可增强这些细胞附着通常对其无亲和性或仅有低亲和性的表面的能力。因此，可以以有利的方式将布雷他汀作为一种增强剂使用，所述增强剂使用户能够促进细胞附着特定基质，例如用于悬浮培养的微载体或覆盖例如的表面。因此，布雷他汀是拓宽用于细胞培养的合适基质选择的有用工具，从而能优化并因此大幅改进依赖于细胞对微载体附着的细胞的培养方法。由于在待培养细胞能够附着的基质方面存在多许多的选择，这促进了培养条件的改进和优化。此外，可以通过向所述细胞添加布雷他汀来实现对用于其它需求但通常不适用于活细胞的合适基质(例如，一些医疗装置的表面)优化的定居表面。因此，用所述抑制剂处理所述细胞使这些细胞有能力在不适于培养这些细胞的表面上附着和增殖。通过本发明所述的方法，大幅拓宽了适用于培养和/或扩增细胞的基质(例如，微载体或医疗装置的)选择。