[发明专利]用于合成含5-羟甲基胞嘧啶的核酸的结构单元和方法

说明书

描述

本发明涉及用于有效合成含5-羟甲基胞嘧啶的核酸（如DNA或RNA）的结构单元和方法。

从四个典型碱基dA、dC、dG和dT构建遗传材料。将dC碱基进一步接受外成的修饰。在真核生物中，dC碱基常常在C5位置是甲基化的，以产生5-甲基胞嘧啶（^5-MedC）¹。最近发现了一种新的基于dC的修饰，其在位置C5替代甲基而含有羟基亚甲基（图1）^2-3。其他人和我们能够表明羟甲基胞嘧啶是大脑中广泛分布的DNA修饰并且其水平根据组织类型而改变^4-5。新的“第六个”碱基^5-HOMedC的功能目前尚不清楚。然而，显示出特定的酮戊二酸依赖性TET（十至十一易位）氧化酶负责其形成^3,6。这些酶将^5-MedC的5-甲基特异性地氧化，以产生^5-HOMedC。最近，发现了这些TET酶的缺失产生了功能错误的干细胞，这提供了碱基^5-HOMedC的形成与细胞发育之间的联系。⁷

为了促进^5-HOMedC依赖性生物过程的生化研究，需要含^5-HOMedC的寡核苷酸（ODNs）的有效合成。目前用于含^5-HOMedC的DNA链合成的结构单元必需通过不稳定的溴-胸腺嘧啶中间产物的相当冗长的化学合成^8-9。此外，包埋的^5-HOMedC单体的去保护需要用浓缩的氨将合成的寡核苷酸在60℃下加热60小时⁹，这阻碍了寡核苷酸的任何衍生，因此对于许多生化实验通常需要用荧光或生物素标记。

本申请涉及从稳定且可购得的起始材料，例如，5-卤脱氧胞苷，优选5-碘脱氧胞苷，产生新的^5-OHMedC结构单元，特别是一些合成步骤中可用的亚磷酰胺结构单元。发现了该结构单元能够使用标准亚磷酰胺化学合成含^5-OHMedC的核酸，并且具有极好的偶联产率。

根据本发明，作为环氨基甲酸酯保护了^5-OHMedC碱基的氨基和羟基。该基团极好地灭活了^5-HOMedC的两个亲核基团并且是最小的可能的保护基团之一，因此使得在DNA合成仪中有效偶联。此外，可以通过在一个步骤中的简单碱处理，将其容易地去保护同时将DNA链与树脂切割，例如，通过在温和条件下用稀释的碱金属氢氧化物溶液处理，例如，室温下12小时。

因此，本发明的第一个方面涉及具有结构式（Ia）或（Ib）的化合物

其中R¹是具有至多20个碳原子，优选至多10个碳原子的直链或环状有机基团，其任选含有杂原子，并且Z是H或环状基团。

通式（Ia）或（Ib）的化合物是受保护的5-羟甲基胞嘧啶化合物，并且优选是受保护的5-羟甲基胞苷化合物。

在化合物（Ia）或（Ib）中，Z优选是5-或6-元环或杂环基团，特别是呋喃酰或吡喃酰基团，更特别是核糖、修饰的核糖或脱氧核糖基团，其中核糖、修饰的核糖或脱氧核糖基团的3'-OH基团可以被含磷的基团，例如，磷酸盐、磷酸酯或亚磷酰胺基团所取代，并且其中核糖、修饰的核糖或脱氧核糖基团的5'-OH基团可以被保护基团，例如，羟基保护基团，如三苯基甲基基团，优选二甲氧基三苯基甲基基团（DMT）所取代。3'-OH和5'-OH基团的连接点可以颠倒，用于逆DNA合成中。

更优选，Z是具有结构式（II）的基团：

其中R²是H、OH、卤素、叠氮基、CN、-(O)C_1-6(卤)烷基、-(O)C_2-6(卤)烯基、-(O)C_2-6(卤)炔基或N(R⁵)₂，其中R⁵在每种情况下独立地是H、C_1-6(卤)烷基或苯基，R³是H、羟基保护基团，例如，如上所述，或是磷酸盐、磷酸酯、亚磷酰胺或H-膦酸酯基团，优选式（III）的亚磷酰胺基团

并且R⁴是如上所示的羟基保护基团，优选三苯基甲基基团，如二甲氧基三苯基甲基（DMT）基团。R³和R⁴的连接点可以颠倒，用于逆DNA合成中。