[发明专利]新型酿酒酵母菌株

说明书

本发明技术领域

本发明涉及一种用于产生酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株的方法，这种酿酒酵母菌株具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因，并且具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率、降低的木糖醇产量以及改进的抑制剂耐受性。本发明另外涉及通过根据本发明的方法可获得的多种酿酒酵母菌株。 

背景技术

关于使用石油作为汽车燃料的环境问题以及还有当今油井将来将被耗尽的危险已引起了关于使用石油的替代方案的深入研究。已发现乙醇是一种石油的良好替代物，因为它在很大程度上可以代替石油使用而不会引起内燃机的重大改变。现今可以在对发动机作非常小的调节或甚至在根本不对发动机作任何调节的情况下使用乙醇代替一些燃料。 

酵母菌属（Saccharomyces）菌株广泛用于供酿造、蒸馏、烘烤以及不同的其他应用的工业中。鉴于酿酒酵母将糖（如葡萄糖和蔗糖）转化为生物质并且将这些糖发酵为乙醇的能力，酿酒酵母是工业应用中使用最广泛的微生物之一。鉴于酿酒酵母菌株相当迅速地将糖转化成乙醇的能力并且由于酿酒酵母与细菌和其他酵母相比对发酵抑制剂和乙醇具有更佳耐受性，酿酒酵母菌株被用于燃料工业中。WO2005/111214披露了具有增加的在抑制剂（如糠醛和5-甲氧基糠醛）存在下产生乙醇的能力的酿酒酵母菌株。 

与细菌和若干个酵母种类不同，野生型酿酒酵母不能使用戊糖（如木糖和阿拉伯糖）作为碳源。酿酒酵母利用丰富碳源（如来自其他工艺的侧 流和废料，如来自例如玉米和甘蔗渣的农业废料以及来自例如造纸的废料）生长的能力具有巨大的环境价值以及还有经济价值。农业废弃物包含相当大部分的半纤维素，这种半纤维素包含许多不同的糖单体。举例来说，除葡萄糖以外，这些糖单体还可以包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖以及阿拉伯糖。木糖是含量最大的糖单体并且因此代表一种用于使用酵母制造乙醇的重要碳源，提供了巨大的经济和环境优点。 

提供使用木糖作为碳源的能力的基因编码酶先前已被引入酿酒酵母中。EP 1 282 686披露了具有被并入的针对酶类木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因并且已经受特异性突变的重组酿酒酵母菌株。所述菌株具有将木质纤维素原料发酵为乙醇的能力。EP 1 282 686中所保藏的菌株是CBS102679（TMB3400，Taurus01）并且在现有技术中总体上被认为是有效的。由菌株CBS102679产生的乙醇已被认为与其他现有技术重组酵母相比是非常好的，但还产生所不希望的副产物木糖醇。因此，鉴于当今社会逐渐增加的环境问题，在本领域内仍需要提供具有甚至更佳乙醇产量、更佳木糖转化率以及更低木糖醇产量的新型酿酒酵母菌株。此外，希望提供具有甚至更佳抑制剂耐受性的菌株。 

发明概述

因此，本发明的目的是解决上述问题并且提供具有更佳木糖转化率、更佳乙醇产量、更低副产物木糖醇产量以及改进的抑制剂耐受性的新颖酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株具有基本上仅使用木糖作为碳源来产生乙醇的能力。 

根据本发明的一个第一方面，使用一种用于产生酿酒酵母菌株的方法来解决这一问题，这种酿酒酵母菌株具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因，并且具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量，这种方法包括以下步骤： 

a)以连续模式，用一种基本上仅包含木糖作为碳源的培养基，在25°C-38°C、优选地30°C-35°C的温度以及0.01vvm-0.06vvm的气流下， 培养具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因的酿酒酵母细胞，并且增加稀释率以维持恒定细胞水平，所述细胞水平通过光学密度或等效分析手段测定在1.5-3.0范围内， 

b)并且添加至少一种抑制剂到这些细胞中并且逐渐增加所述抑制剂的添加。 

重要步骤是维持生物反应器中的细胞水平恒定。当已进化出改进的细胞时，这些改进的细胞可以以通过稀释率设定的特定生长速率更佳地利用底物，改进的结果是将形成更多个细胞。这意味着为保持选择压力，需要生长速率增加，生长速率增加是通过增加稀释率来获得的。 

根据本发明的一个实施例，步骤a)的该培养基包含15g/l-25g/l的木糖、优选地约20g/l的木糖。 

在又一个实施例中，该方法另外包括步骤 

c)在培养期间，例如在步骤a)或b)之后，将温度增加到35°C-45°C和/或施加紫外辐射。