[发明专利]源自生药的成分的高灵敏度定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于对生物样品中的甘草甜素及其代谢物等高灵敏度地进行定量的方法。

本申请基于并要求于2010年11月16日提交的日本专利申请2010-256187号的优先权，并将其全部内容结合于此，作为参考。

背景技术

甘草甜素(以下简称GL)及其盐是具有抗过敏作用、抗炎症作用、以及免疫调剂作用、肝细胞损害抑制作用、肝细胞繁殖促进作用、病毒繁殖抑制作用/灭活作用等多种多样生理活性的甘草根提取成分。在日本，自古以来被用作中药等的临床药物，现在被广泛用于治疗慢性肝脏疾病、湿疹/皮炎、婴儿苔癣、圆形脱毛症(円形脱毛症)、各种过敏、炎症等。并且，作为除医药品之外的用途，由于GL具有耐盐(塩なれ)效果并具有甜味效果，因此作为甜味剂多用于腌菜和调料等众多食品。

根据非临床试验的结果认为，GL具有容易积聚在肝脏且迅速被排泄至胆汁中的特性，并一边进行代谢以及肠肝循环一边被排出。特别是口服给药中，作为配糖体(配糖体)的水溶性极性物质的GL显示低吸收性，同时由于被肠道细菌代谢和首过效应，在末梢血液中的浓度极低。因此，为了测定GL的血液中的动态，迄今为止已经尝试过各种各样的方法，但是难以检测服用含GL的制剂、掺合甘草的中药制剂时血液中的GL，长期以来也不清楚其动态。

例如，存在以下测定方法：对采自口服GL后的健康者的血浆，进行甲醇处理除去蛋白质后，通过酶免疫法(EIA)测定该血浆中的GL的量的方法；以及利用采用了十八烷基化学结合型(ODS)柱等具有反相分配功能的柱的高速液相色谱法(HPLC)的测定方法(例如非专利文献1～4)。但是，这些测定方法中，定量临界值最多为0.1μg/mL左右，即使能够检测出作为主代谢物的甘草次酸(以下简称为GA)，也无法检测出GL。因此，根据从尿中检测的示例，间接证明了GL的血液中转移(参照非专利文献4)。于是，对含GL的制剂的药效，以可定量的GA代替GL作为评价指标。

在先技术文献

非专利文献

非专利文献1：石渡(イシワタ)，其他7名，《生化及药剂学期刊》(バイオロジカル·アンド·フア一マシユ一テイカル·ブリテン(Biological and Pharmaceutical Bulletin))，2000年第23卷第8号第904～905页。

非专利文献2：德·格鲁特(De Groot)，其他1名，《色谱法杂志》(ジヤ一ナル·オブ·クロマトグラフイ一(Journal of Chromatography))，1988年第456卷第71～81页。

非专利文献3：中田(ナカタ)，其他3名，《和汉药学会志》(和漢医薬学会誌)，1986年第3卷第3号第278～279页。

非专利文献4：山村(ヤマムラ)，其他7名，《美国药学杂志》(ジヤ一ナル·オブ·フア一マシユ一テイカル·サイエンシズ(Journal of Pharmaceutical Sciences))，1992年第81卷第10号第1042～1046页。

发明内容

发明要解决的技术问题

作为活性主体的原形药物GL的药代动力学，在根据有效性、安全性判断为恰当使用后，是有用的。为此，希望不以GA为评价对象，而能够对血浆等生物样品中的GL量进行定量。

鉴于上述技术问题，本发明的目的在于提供用于检测血浆等生物样品中的GL并进行定量的方法。

解决技术问题的技术方案

为解决上述技术问题，本申请各发明人进行了深入研究，结果发现，首先，利用采用了具有反相分配功能以及阴离子交换功能的固相的固相提取法从生物样品中提取出含有GL的成分后，通过质谱法分析提取物中的GL，能够检测并定量生物样品中的GL，至此完成本发明。

即，本发明提供以下内容：

(1)一种源自生药的成分的高灵敏度定量方法，其特征在于，具有：提取工序，通过将碱或醇中混合有生物样品的混合物注入具有反相分配功能及阴离子交换功能的固相中后，用清洗液对上述固相清洗至少一次，之后利用酸性醇从上述固相中洗脱，从而制备含有源自生药的成分的提取物；以及定量工序，通过质谱法对经由上述提取工序提取的提取物中的选自由甘草甜素、甘草次酸、甘草甜素及甘草次酸的代谢物、甘草甜素及甘草次酸的类似物、甘草中含有的皂苷成分以及它们药学上可接受的盐组成的组中的至少一种进行检测，并定量，其中，上述清洗液是选自由水、碱、醇及乙腈组成的组中的一种或两种以上的混合液。