[发明专利]用于体外基因毒性试验的合适的肝细胞

说明书

本发明涉及借助于增殖的生理活性肝细胞的细胞培养系统对化学、生物和物理活性物质或试剂进行基因毒性试验的方法。

该方法特别适合人类和动物中已知药物和新药和活性物质以及其组合的基因毒性试验。而且，它适合测试食物、化妆品、纺织品、材料中的化学或生物学活性物质和其它物质在人类和动物中的基因毒性效应。

在许多工业领域如制药、化妆品、食品和化学工业中，例如，新的化学品和/或生物学活性物质和其组合被不断地发展，其对人们健康的潜在的有害效应通常是未知的。这里，完全不同的效应可发生在人类或动物中。除了在治疗意义内的预期效应，药物、化学品或生物学活性物质还可，例如，产生不希望的副作用如肝损伤、对心肌的损伤、神经毒性或致畸性。就此可能导致器官的许多细胞丧失直至退行性器官疾病，例如心力衰竭或肝损伤。该毒性的原因可能在于细胞的基本所有区室和功能的受损伤或受影响，这是说，例如，细胞膜的损伤、对生理过程如细胞呼吸、胞内运输、信号传导和基因表达的影响——仅举几个例子。本发明涉及试剂对人类或动物细胞中的遗传物质DNA构成的直接或间接作用及其借助所谓的基因毒性试验的适宜的测试。

提供用于测试的适宜细胞是医学和诊断的挑战，特别在体外细胞体系——包括相关的细胞培养物——的发展中。

因此，对建立与人类细胞尽最大程度可能相似的细胞培养物/细胞体系存在大的需求，以便可进行有效的体外基因毒性试验。

现有技术已建立了细胞系，其是可在适当的培养基上无限地繁殖和永生的细胞。特别地已知肿瘤细胞或肿瘤样细胞，如HeLa细胞-宫颈癌细胞系、COS细胞、HEK-293细胞-肾、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、HEp-2-人上皮细胞喉癌细胞系和更多的细胞系。这样的细胞系的产生例如描述于EP833934（Crucell），这样的细胞系例如用于药物检测。然而，这样的细胞系的缺点是遗传改变（如点突变、染色体部分易位（重排）、基因拷贝数增加（基因扩增）、甚至染色体组改变（非整倍性））以及由于缺乏接触抑制的肿瘤性质，借此细胞能够在软琼脂基质上体外生长。肿瘤细胞额外具有由无限增殖性而产生的不受限的分裂能力。已知由于自发突变，这样的细胞系的细胞在培养过程中逐渐转变并可发展成恶性细胞群并在遗传上不稳定。基于发明人的认识，仅大约60次细胞分裂之后，在培养物中出现累积突变的临界阈。这些可以是导致癌基因的激活或肿瘤抑制基因的失活的突变。

因此，能够在细胞群中占优势的细胞是由于累积突变而显示增加的细胞分裂活性的那些细胞。该选择过程对应于肿瘤进展中的癌前状态；另外，商业上可获得的细胞系如果它们不源于恶性肿瘤细胞开始，通常已经历了未知数目的倍增过程。

此外，以下的基因毒性试验在现有技术中被描述：

在所谓的埃姆斯试验（Ames et al.,1973a;Ames et al.,1973b）中，将由于突变，例如基因中的点突变，不再能够合成特定氨基酸（营养缺陷型突变体）的细菌施加到不含有该氨基酸的培养基（琼脂）。因为这些细菌依赖该氨基酸用于它们继续的生存，所以它们将死亡或不能在该营养缺乏的培养基上繁殖。然后将细菌暴露于潜在的诱变物质，例如通过将在其中浸透的滤纸置于培养基上。如果在随后的温育之后所谓的细菌菌落形成，那么单一细菌已生长并已恢复合成相应的氨基酸的能力。这些被称作回复菌落，其中导致营养缺陷的基因中的点突变已被逆转。

在染色体畸变试验中，将待测物质与细胞温育。确定的温育时期之后，分析发生的染色体畸变，例如通过核型分析。该方法允许多个染色体畸变可见，如，例如，双着丝粒染色体的发展、染色体断裂和姐妹染色单体互换（Morita et al.,1989）。

Broschinski和同事们报道了776化学物质的常规基因毒性测试，其中细菌突变试验（埃姆斯试验）和染色体畸变试验的组合为检测诱变剂提供最佳的灵敏度（Broschinski et al.,1998）。