[发明专利]用作神经干细胞探针的氟硼二吡咯结构荧光染料

说明书

相关申请

本申请要求2010年11月24日提交的美国临时申请号61/416,808的权益。上述申请的全部技术通过参考并入此处。

背景技术

荧光分子及其应用的开发对于多种生物现象的分析都是不可或缺的技术。在过去的几十年中，许多荧光小分子已开发作为用于生物分析的报告物和化学传感器，其通常被精心设计成选择性检测目标物质，或是与生物分子缀合¹。这些荧光分子利用其发光强度的提高或降低，所述提高或降低是对周围介质的响应，或是通过特定的分子识别事件实现。由于其简单并且灵敏度高，荧光传感器已作为常用工具广泛用于化学、生物和医学应用。荧光传感器设计的最普遍的策略是将荧光染料分子与针对特定分析物设计的受体组合在一起，期望受体与分析物之间的识别事件会导致染料部分的荧光特性改变。虽然已经通过该方法成功开发了许多荧光传感器，但是每一次开发都需要将大量精力放在传感器的设计和合成上。此外，传感器的应用范围仅限于对该传感器进行推理性设计时所针对的所选具体分析物，即所谓的分析物导向型传感器。一旦可以开发用于不同种类染料的高效合成路线，组合染料库合成就会提供作为多样性导向型传感器的最有前途的替代品之一。

神经干细胞(NSC)在整个生命周期中通过自我更新和分化成神经元和神经胶质而产生神经系统、促进神经元的可塑性并修复损伤^2，3。向一些脑部疾病影响的脑区域中进行的NSC植入的有益影响已通过动物实验证明^4，5。NSC对于药物筛选及药效试验而言也具有在药物开发中显著减少所需的时间和努力的巨大潜力。分离和表征NSC的常规方法依赖于其在确定的培养基中的行为，如神经球(neurosphere)的形成和标志物分子的免疫检测。然而，这些方法依赖于时间，并涉及使用可能致使细胞不适合于进一步实验和治疗应用的抗体。因此，需要开发可用于检测神经干细胞的新的化合物。

发明概述

描述了具有荧光发射并对神经干细胞具有特异性的新的化学结构。该骨架与一系列化学官能团是相容的，并能够与蛋白质以及其他目的大分子(诸如碳水化合物和脂质)进行生物缀合。这些化合物之一(称为指定化合物(CDr3))通过与脂肪酸结合蛋白7(FABP7)这种NSC标志物蛋白结合而选择性染色人类和小鼠神经干细胞(NSC)。

附图说明

从以下对附图所示本发明示例性实施方案的更具体描述，前面提到的将是显然的，在附图中相似的附图标记表示不同视图中的相同部分。这些附图不一定是按比例绘制的，而是将重点放在展示本发明的实施方案上。

图1A示出了CDr3对NS5的选择性染色。E14、NS5、D-NS5和MEF的细胞核都被Hoechst 33342(DAPI)可视化；但是只有NS5被CDr3(TxRd)选择性染色。上图是明视野(BF)图像；中图和下图是用DAPI和Texas Red滤光片组得到的荧光图像。比例尺，50μm。

图1B示出了CDr3的化学结构。

图1C示出了与CDr3一起孵育的E14、NS5、D-NS5和MEF的流式细胞术散点图。向未染色的对照细胞添加DMSO。将每种类型细胞的图像叠加。标出了CDr3分离的NS5细胞。

图1D示出了CDr3对NS5的选择性染色。将在体外培养了2周的混合原代小鼠脑细胞(PC)与CDr3和Hoechst 33342一起孵育。活细胞的图像示于明视野(BF)和荧光(DAPI和Texas Red)的图中。多种形态的原代脑细胞没有被CDr3染色，而并行处理的被NS5染色。在用神经元特异性III类β-微管蛋白(TUJ1；TXRD通道)和星形胶质细胞特异性的胶质纤维酸性蛋白(GFAP；FITC通道)的抗体进行免疫细胞化学染色(ICC)后，获得了相同细胞的图像。比例尺，100μm。

图2A示出了CDr3结合蛋白的鉴定。通过2DE分离CDr3染色的NS5的蛋白质裂解物。主要荧光点用圈(左图)标记。在一式二份的凝胶(右图)中检测到许多银染色的蛋白质点。

图2B示出了胰蛋白酶肽(MVVTLTFGDIVAVR)SEQ ID No.：1的MS/MS碎片离子分析，表示FABP7是CDr3的结合靶标。在谱图中仅标记出了主y-系列的离子碎片。M^＊表示在甲硫氨酸残基上的氧化。