[发明专利]亲和色谱基质

说明书

发明领域

本发明涉及亲和色谱法领域，且更具体涉及含有配体的分离基质，所述配体含有一个或多个蛋白A结构域（E、D、A、B、C）或蛋白Z，具有在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸残基（C-terminal most proline residue）的氨基酸取代。本发明还涉及用具有增加能力(capacity)的优势的前述基质分离目标蛋白质的方法。

发明背景

免疫球蛋白为全球范围内生产或研发中最普遍的生物制药产品。其特定治疗市场的高度商业化需求和由此带来的价值已导致制药公司将重点放在将其各自的mAb生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。

大多数情况下使用亲和色谱法作为这些免疫球蛋白分子（例如单克隆或多克隆抗体）纯化中的关键步骤之一。特别有意义的一类亲和试剂是能特异性结合免疫球蛋白分子的恒定部分的蛋白质，这样的相互作用不依赖于抗体的抗原结合特异性。这样的试剂可广泛用于从不同样本中用亲和色谱法回收免疫球蛋白，所述样本例如但不限于血清或血浆制备物或得自细胞培养物的原料。这样的蛋白质的一个实例为葡萄球菌蛋白A，其含有能与不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分相结合的结构域。

基于葡萄球菌蛋白A（SpA）的试剂因为其高度亲和力和选择性在生物技术领域已经发现了广泛的用途，例如用于捕获和纯化抗体以及检测的亲和色谱法。目前，基于SpA的亲和介质可能是最广泛使用的从不同样本中分离单克隆抗体及其片段的亲和介质，所述样本包括来自细胞培养物的工业原料。因此，各种包含蛋白A配体的基质可市购获得，例如以天然蛋白A的形式（例如Protein A SEPHAROSE?, GE Healthcare, Uppsala, Sweden），还可由重组蛋白A组成（例如rProtein A SEPHAROSE?, GE Healthcare）。更具体地说，在市售的重组蛋白A产品中进行的基因操作的目的在于促进其附着至支持物。

这些应用，与其他亲和色谱法应用类似，需要充分注意一定要去除杂质。这样的杂质可例如为色谱程序中吸附在固定相或基质上的非洗脱分子，例如不期望的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。通常在所期望产品的第一次洗脱之后从基质上去除这样的杂质，以便于在后续使用之前使基质再生。这样的去除通常涉及称为原位清洗（cleaning-in-place, CIP）的程序，其中使用能从固定相上洗脱杂质的试剂。经常使用的一类这样的试剂为流过所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洗和清洁试剂为NaOH，其浓度范围可为0.1M直到例如1 M，这依赖于杂质的程度和种类。这个策略涉及将基质暴露于超过13的pH值中。对许多含有蛋白性质的亲和配体的亲和色谱基质来说，这样的碱性环境为非常苛刻的条件，因此由于配体对有关高pH的不稳定性而导致能力下降。

因此，广泛的研究已集中在工程改造蛋白质配体的研制上，所述蛋白质配体显示出耐受碱性pH值的能力提高。例如，Gülich等(Susanne Gülich, Martin Linhult, Per-?ke Nygren, Mathias Uhlén, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178) 提出了蛋白质工程改造，以在碱性环境中提高葡萄球菌白蛋白结合结构域（ABD）的稳定性。Gülich等创建了ABD的突变体，其中所有的4个天冬酰胺残基被亮氨酸（1个残基）、天冬氨酸（2个残基）和赖氨酸（1个残基）置换。此外，Gülich等报道了其突变体显示类似于天然蛋白的靶蛋白结合特性，并且在重复暴露于碱性环境后，含有工程改造的配体的亲和柱比用亲本未改造的配体制备的亲和柱显示出更高的结合能力。因此，从中推断出可置换所有的4个天冬酰胺残基而对结构和功能没有任何明显的影响。