[发明专利]用于在植物中表达脱氧核糖核酸酶的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种用于在植物中表达重组脱氧核糖核酸酶、合适地表达人DNA酶I的方法。也公开用于实施所述方法的核酸序列、核酸构建体、载体、表达载体等。

背景技术

脱氧核糖核酸酶(DNA酶)是水解多脱氧核糖核酸的磷酸二酯酶，并且已知以几种分子形式出现。基于其生物化学特性和酶活性，已经将DNA酶蛋白划分为两种类型：DNA酶I和DNA酶II。DNA酶I蛋白具有近中性的最佳pH(二价阳离子的必备要求)并且在水解DNA时产生5′-磷酸核苷酸。DNA酶II蛋白展示酸性最佳pH，可以被二价阳离子激活，并且在水解DNA时产生3′-磷酸核苷酸。

已经描述了来自各个物种的DNA酶蛋白，包括牛DNA酶I和猪DNA酶I。已经纯化这些蛋白质并且编码它们的核苷酸序列已经测序。编码人DNA酶I的DNA也已经分离并测序并且在哺乳动物细胞–如CHO细胞中表达，因而可以产生人DNA酶。也已经鉴定了编码与人DNA酶I具有同源性的其他多肽的DNA。

DNA酶I具有众多治疗目的。其治疗性用途之一是在患有疾病-如肺炎和囊性纤维化的受试者中降低肺分泌物(粘液)的粘弹性，因而辅助清理呼吸道。粘液也促进慢性支气管炎、哮喘支气管炎、支气管扩张症、气肿、急性和慢性窦炎以及甚至普通感冒的病态，因此DNA酶I也可以应用于这种疾病。

现存的真核表达系统的生物化学、技术及经济局限性已经在开发用于异源蛋白的新系统时引起巨大的兴趣。为此目的，植物表达系统可以用来产生重组蛋白。然而，在开发基于植物的表达系统期间不得不考虑众多变量，因为不可能预测重组蛋白是否将在植物中成功表达。因而，开发基于植物的表达系统不是简单明了的，并且不存在以下必然性：最终开发的系统将是一个导致有效表达选定蛋白质的系统。

DNA酶是一种难以在异源系统中表达的酶，并非最不重要地部分归因于该酶发挥水解DNA作用的活性。另外，现有的DNA酶表达系统利用哺乳动物细胞作为表达宿主，这意味所表达的蛋白质的下游加工(例如，纯化和放大)不可容易地放大至商业水平。由本发明提供的方法旨在提供改进的DNA酶表达系统。

发明概述

本发明至少部分地基于以下令人惊讶的研究结果：可以在植物中以活性形式在促使这种表达系统成为商业生产DNA的合适选择的水平表达这种酶。就发明人目前所知，先前未曾报道在植物中表达DNA酶。

根据一个实施方案，使用一种基于融合蛋白的表达系统，因为这可以改善DNA酶的下游回收-如从植物材料回收和纯化该酶。发明人发现，诱导蛋白体在植物中形成的融合蛋白配对体可以成功地用来在植物中表达DNA酶。令人惊讶地，使用编码DNA酶和诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核酸构建体，连同在诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质中使用一个或多个非天然存在的重复序列基序，可以与不存在所述基序相比，增加DNA酶的表达水平。

本文所述的表达系统特别可用于以这样方式产生DNA酶，所述方式可放大用于这种酶的商业生产。

根据一个方面，提供一种用于在植物中表达DNA酶的方法，所述方法包括培育已经向其中导入核酸构建体的植物，所述核酸构建体包含在调节性核苷酸序列控制下编码DNA酶的核酸序列，所述调节性核苷酸序列调节所述核酸序列在所述植物中的转录。

在又一方面，提供一种用于在植物中表达DNA酶的方法，所述方法包括步骤：(a)向植物中导入在调节性核苷酸序列控制下编码DNA酶的核酸序列，所述调节性核苷酸序列调节所述核酸序列在植物中的转录，和任选地，编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核酸序列，其中所述核酸序列彼此有效连接；和(b)在允许DNA酶作为融合蛋白在所述植物中表达的条件下培育所述植物。

提供一种用于在植物中表达DNA酶的方法，所述方法包括使用核酸构建体，所述核酸构建体包含以下核酸序列、由其组成或基本上由其组成：在调节性核苷酸序列控制下编码DNA酶的核酸序列，所述调节性核苷酸序列调节所述核酸序列在植物中的转录，和任选地，编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核酸序列，其中所述核酸序列彼此有效连接。

在第一方面，提供一种用于在植物中产生DNA酶的方法，所述方法包括培育或培养已经向其中导入或浸润核酸构建体的植物，其中所述核酸构建体包含编码DNA酶融合蛋白的核酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述DNA酶融合蛋白包含诱导蛋白体在植物中形成的融合蛋白配对体。

在一个实施方案中，在培育或培养步骤之前进行导入或浸润植物的步骤。