[发明专利]用于原位检测核酸的超灵敏方法

权利要求书

1.检测至少一种目标核酸的方法，所述方法包括：

（a）提供包含或怀疑包含所述目标核酸的样品；

（b）提供能够杂交至所述目标核酸的至少一组两个或更多个捕获探针；

（c）提供能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的组的信号产生多聚体，其中所述信号产生多聚体包含标记探针；

（d）提供能够结合至所述标记探针的信号放大探针，其中所述信号放大探针包含标记物；

（e）将所述目标核酸杂交至所述两个或更多个捕获探针的组；

（f）将所述信号产生多聚体捕获至所述两个或更多个捕获探针的组并借此将所述信号产生多聚体捕获至所述目标核酸；

（g）将所述信号放大探针捕获至所述标记探针并借此将所述信号放大探针捕获至所述信号产生多聚体；和

（h）检测所述标记物的存在、不存在或量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的生物素分子，能够结合至所述生物素分子的抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子，以及结合至辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）或荧光团并且能够结合于所述抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子的另外的生物素分子。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的HRP、AP、二硝基苯基（DNP）或荧光团分子，能够结合至所述HRP、AP、DNP或荧光团分子的一种或多种第一抗体，以及结合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或荧光团并且能够结合于所述一种或多种第一抗体的一种或多种第二抗体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的HRP分子、能够与所述HRP分子反应的多个酪胺-生物素或酪胺-荧光团分子、以及能够可见地检测所述酪胺-生物素或酪胺-荧光团分子的检测标记物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述检测标记物是抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-HRP和显色底物的组合或抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP和显色底物的组合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述显色底物选自：二氨基联苯胺（DAB）和固红。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述信号产生多聚体包含（i）能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的组的所述标记探针，（ii）所述标记探针和杂交至所述标记探针并且能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的组的扩增子，和（iii）所述标记探针、杂交至所述标记物的扩增子、和杂交至所述扩增子并且能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的组的预扩增子。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述预扩增子:扩增子之比为1-16之间、2-10之间或2-5之间。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述目标核酸选自：DNA、cDNA、RNA和mRNA。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤（a）包括将所述目标核酸捕获到固体载体上。

11.根据权利要求8所述的方法，其中，在步骤（a）中，所述样品包含细胞，所述细胞包含或怀疑包含所述目标核酸。

12.根据权利要求8所述的方法，其中，在步骤（a）中，所述样品包含细胞，所述细胞包含或怀疑包含两种或更多种不同的目标核酸。

13.根据权利要求8所述的方法，其中，在步骤（a）中，所述样品包含两种或更多种不同的细胞，所述细胞中的每一种包含或怀疑包含不同的目标核酸。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，利用双色显色原位杂交（CISH）或双色荧光原位杂交（FISH）来检测两种不同的目标核酸。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，利用两种不同的信号放大探针来实施所述双色CISH，其中第一信号放大探针包含：酪胺-生物素、抗生蛋白链菌素-HRP和DAB，而第二信号放大探针包含：抗-DNP-AP和固红。