[发明专利]具有高丝氨酸乙酰转移酶活性的修饰多肽和表达其的微生物

说明书

背景技术

1、发明领域

本发明涉及被修饰以具有高丝氨酸乙酰转移酶活性的多肽、编码其的多核苷酸、包括该多核苷酸的重组载体、用该重组载体转化的微生物和利用该微生物生产O-乙酰高丝氨酸的方法。

2、相关技术的描述

甲硫氨酸是体内的必需氨基酸之一，并已经广泛用作动物饲料和食品添加剂，以及医学水性溶液的成分和医药产品的其他原料。甲硫氨酸作为胆碱(卵磷脂)和肌酸的前体，并且也用作半胱氨酸和牛磺酸合成的原料。此外，它作为硫供体起作用。

S-腺苷-甲硫氨酸源于L-甲硫氨酸并用作体内的甲基供体，并且它参与大脑中多种神经递质的合成。也发现甲硫氨酸和/或S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)预防在肝脏和动脉中的脂质积累和有效治疗抑郁症、炎症、肝脏疾病和肌肉痛。

甲硫氨酸可被化学或生物合成，以用于动物饲料、食品和药品。

在化学合成中，L-甲硫氨酸主要由5-(β-甲基巯乙基)-乙内酰脲的水解生产。然而，化学合成的甲硫氨酸具有仅作为混合形式的L-型和D-型生产的缺点。

关于L-甲硫氨酸的生物合成，美国专利公布号US2005/0054060A1描述了以下方法：直接利用H₂S或CH₃SH，而不使用半胱氨酸，通过修饰用于微生物制备的胱硫醚合酶合成高半胱氨酸或甲硫氨酸。在该方法中，被修饰的胱硫醚合酶被直接引入细胞，以根据细胞内甲硫氨酸合成过程合成甲硫氨酸。然而，存在如下实际问题，其中因为由利用细胞内甲硫氨酸代谢途径合成的甲硫氨酸引起的抑制作用，该方法仅产生少量甲硫氨酸，并且H₂S或CH₃SH也引起细胞毒性。

为了解决这些问题，本发明人已经开发了通过酶反应将L-甲硫氨酸前体转变成L-甲硫氨酸的两步法(PCT/KR2007/003650)。该两步法可解决H₂S或CH₃SH的细胞毒性和产生的L-甲硫氨酸的代谢过程抑制的问题。此外，该方法的特征为选择性地仅生产L-甲硫氨酸，而不是混合形式的D-甲硫氨酸和L-甲硫氨酸非常有效。

在该两步法中，O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸可用作甲硫氨酸前体。在甲硫氨酸的转化反应期间，就前体与甲硫氨酸比率的生产率而言，O-乙酰高丝氨酸优于O-琥珀酰高丝氨酸。具体地，可从1摩尔的O-乙酰高丝氨酸生产0.91摩尔的甲硫氨酸，而可从1摩尔的O-琥珀酰高丝氨酸生产仅0.67摩尔的甲硫氨酸。因此，最终产物甲硫氨酸的生产成本可通过将O-乙酰高丝氨酸用作甲硫氨酸前体而降低，并且O-乙酰高丝氨酸的高生产率为甲硫氨酸大量生产的关键因素。

同时，将O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸作为甲硫氨酸前体的使用取决于微生物的类型。详细地，属于埃希氏菌(Escherichia)属、肠细菌(Enterobacteria)属、沙门氏菌(Salmonella)属和芽胞杆菌(Bacillus)属的微生物，通过L-高丝氨酸O-琥珀酰转移酶从高丝氨酸和琥珀酰-coA生产O-琥珀酰-高丝氨酸(Biochemistry.1999Oct26;38(43):14416-23)，和属于棒状杆菌(Corynebacterium)属、钩端螺旋体(Leptospira)属、奇异球菌(Deinococcus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属和分支杆菌(Mycobacterium)属的微生物通过L-高丝氨酸O-乙酰转移酶从高丝氨酸和乙酰辅酶A生产O-乙酰高丝氨酸(Journal of Bacteriology,Mar.2002,p.1277-1286)。

因此，利用用于为了实验和工业目的生产重组蛋白的埃希氏菌属的微生物，生物合成O-乙酰高丝氨酸，需要通过引入metX——一种外源基因——表达O-乙酰高丝氨酸转移酶。然而，存在与消费者对于外源基因引入用于生产食品的微生物的否定态度和证明外源基因引入的安全性相关的问题。

因此，本发明人已经做出努力，以制备埃希氏菌属的菌株，所述菌株产生就生产率而言有利的O-乙酰高丝氨酸，而不引入外源基因。结果，他们发现通过使用由用谷氨酸替代在来自大肠杆菌的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶的位置111处的氨基酸制备的修饰多肽，可将高丝氨酸琥珀酰转移酶活性转变成高丝氨酸乙酰转移酶活性，由此完成本发明。

发明内容

本发明的目的是提供修饰多肽，其中具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的该多肽被转变为具有高丝氨酸乙酰转移酶活性。