[发明专利]用于获得高产量重组蛋白表达的基于MGMT的方法

说明书

技术领域

本发明涉及遗传工程和分子生物学领域。特别是，本发明涉及一种宿主细胞中蛋白生产的新型增强子。此外，本发明涉及含有编码所述增强子蛋白的DNA序列的载体，及其用于表达重组蛋白的用途，如工业用酶或药用蛋白，包括真核（例如，哺乳动物，如人）和病毒蛋白。

背景技术

蛋白生产系统，其中在重组生物体或细胞中生产兴趣多肽或蛋白，是商业生物技术的主干。

最早的系统，基于在宿主如大肠杆菌中的细菌表达，已加入了基于真核宿主的系统，特别是培养的哺乳动物细胞、培养的以及整个昆虫形式的昆虫细胞，和转基因哺乳动物如绵羊和山羊。

原核细胞培养系统易于维护且操作便宜。然而，原核细胞不能进行真核蛋白的翻译后修饰。此外，许多蛋白不能正确折叠，需要特殊的程序使其重新折叠，这增加了生产成本。

真核细胞培养系统已经描述了多种应用。例如，哺乳动物细胞能够进行翻译后修饰，且通常产生正确折叠的和可溶性蛋白。哺乳动物细胞系统的主要缺点包括需要专门的和昂贵的培养设施、感染的风险，这可能会导致整个培养物的损失、以及潜在的有害哺乳动物蛋白污染最终产品的风险。交替使用昆虫细胞用来表达多肽。昆虫细胞中所用的最普遍的表达系统基于杆状病毒载体。在强天然多角体蛋白启动子的控制下，通过用异源基因替换编码杆状病毒主要结构蛋白的杆状病毒多角体蛋白基因来构建杆状病毒表达载体。用重组病毒感染培养的昆虫宿主细胞，可以从细胞本身中回收由此产生的蛋白，或者如果采用合适的分泌信号时，从培养基中回收由此产生的蛋白。

然而，这两种系统，都存在重组蛋白表达水平和质量的再现性、培养物感染的相关问题，并且需要专门的培养设施。此外，用于某些蛋白生产而不得不在GMP条件下制备的杆状病毒原料，随着时间的推移并不总是稳定的。

果蝇细胞，特别是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）S2细胞，已被US5,550,043、US5,681,713和US5,705,359所公开用于蛋白的表达。不同于现有技术的杆状病毒系统，在其中只有裂解感染的昆虫细胞时才能提供兴趣蛋白，基于S2细胞的方法提供连续的异源蛋白的细胞表达系统，并因此产生更高的表达水平。

已经提出了几个其它用于增强异源蛋白在宿主细胞中表达的装置：例如，US5,919,682描述了在原核生物中使用pCW载体在tac启动子的控制下、共表达蛋白和分子伴侣过量生产功能性硝酸合酶的方法。此外，US4,758,512涉及在其DNA序列内具有特定突变的宿主细胞的生产，其导致生物体表现出降解外源产物的能力降低。这些突变的宿主生物体可用于增加遗传工程的外源蛋白的产量。

脊椎动物细胞，特别是哺乳动物细胞，也被广泛用于重组蛋白的表达。来自培养中生长的细胞的蛋白生产的量，随着时间，依赖于若干因素，如，例如细胞密度、细胞周期相、蛋白的细胞生物合成速度、用以支持细胞活力和生长的介质条件、以及细胞在培养中的寿命（即多久之后它们死于程序性细胞死亡或凋亡）。例如通过控制营养物、细胞密度、氧和二氧化碳的含量、乳酸脱氢酶、pH、渗透性、代谢物等，已经开发了改善细胞在培养中的活力和寿命的各种方法，以及提高所需蛋白的产量的方法。

其它的宿主细胞可用于生产异源重组蛋白，特别是植物细胞和酵母细胞。

在植物中已经合成了哺乳动物来源的许多药物蛋白。这些从血液制品，如有着每年超过500吨需求量的人血清白蛋白，到需要更少量的细胞因子和其它信号分子。大多数植物来源的蛋白已在转基因烟草中生产，并直接从叶中提取。一般情况下，这些蛋白以较低的水平生产，通常小于总可溶性蛋白的0.1%。这样低水平的生产尤其反映出各种因素的组合，其中最重要的是蛋白折叠和稳定性差。最近，烟草叶绿体系统已被用于以更高的水平表达人类蛋白（MA JKC等人，2004）。