[发明专利]用于检测野生型群体中的核酸突变体的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种引物依赖性DNA扩增方法，其用于选择性扩增包含丰富的靶序列的第一变体的样本中的DNA靶序列的稀有第二变体，其中所述第二变体与所述第一变体相异至少一个核苷酸，所述方法包括

a)制备包含所述样本和扩增试剂的反应混合物，所述扩增试剂包括将所述靶序列包括在其间的第一线性引物和第二线性引物，和其在所述靶序列上的结合位点在所述第一引物的所述靶结合位点下游并且包括所述至少一个核苷酸差异的额外的引物阻断发夹型寡核苷酸，

其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸的所述靶结合序列优选地与所述靶序列的所述第一变体完全互补，其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸的所述靶序列上的所述结合位点与所述第一引物的所述靶序列上的所述结合位点重叠至少一个核苷酸，其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸在扩增开始时具有比其针对所述靶序列的所述第二变体的对应解链温度高至少5℃的针对所述靶序列的所述第一变体的浓度调节的解链温度，并且其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸在所述引物不与所述靶序列杂交的温度下但以为所述第一引物结合所述靶序列的速率的至多1/5的速率与所述靶序列的所述第一变体杂交；和

b)使所述反应混合物经历热循环方案，所述热循环方案包括解链、引物退火和引物延伸的步骤的重复循环，

其中至少所述初始循环在所述引物退火步骤之前另外包括阻断剂结合步骤，所述阻断剂结合步骤具有这样的温度，在该温度下所述引物阻断发夹型寡核苷酸仅结合所述靶序列的所述第一变体并且所述引物不结合所述靶序列，以及该温度具有足以使所述引物阻断发夹型寡核苷酸饱和所述靶序列的所述第一变体的持续时间，并且其中所述引物退火步骤具有不足以使所述引物阻断发夹型寡核苷酸结合所述靶序列的所述第二变体的持续时间。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在扩增开始时，所述引物阻断发夹型寡核苷酸具有比其对应的针对所述靶序列的所述第二变体的解链温度高至少7℃的针对所述靶序列的所述第一变体的浓度调节的解链温度。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法是非对称扩增方法，其中所述第一引物是限制引物并且所述第二引物是过剩引物，其中过剩引物与限制引物的比率为至少5:1，并且其中扩增开始时所述限制引物的所述浓度调节的解链温度至少等于扩增开始时所述过剩引物的所述浓度调节的解链温度。

4.根据权利要求3所述的方法，其中扩增开始时所述限制引物的所述浓度调节的解链温度比扩增开始时所述过剩引物的所述浓度调节的解链温度高3-10℃。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包括至少一种均质检测试剂，并且所述方法包括至少一种扩增产物的均质检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸被标记以便参与所述均质检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸在其3’端包括淬灭剂，并且所述反应混合物包括短茎分子信标探针，所述探针在其5’端包括荧光团，在其3’端包括淬灭剂，并且在紧接所述引物阻断发夹型寡核苷酸的下游杂交。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述热循环方案包括多个不包括所述阻断剂结合步骤的热循环。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中包括所述阻断剂结合步骤的初始循环被1至10个不包括所述阻断剂结合步骤的循环中断。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述中断后所述阻断剂结合步骤包括在不超过2个循环中。

11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述热循环方案包括至少10个初始循环，所述循环包括所述阻断剂结合步骤和低至足以使所述第一引物结合但低至不足以使所述第二引物结合的引物退火温度，由此所述第二变体在利用两种引物的指数扩增开始之前通过所述第一引物的结合和延伸被线性扩增。

12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述引物的至少一个被修饰以在扩增过程中具有两个浓度调节的解链温度，针对所述初始靶序列的低解链温度和针对所述反应中产生的产物链的高解链温度，并且其中所述热循环方案包括至少一个具有低至足以使所述至少一种引物在其低解链温度下结合的引物退火温度的循环和多个具有高至足以使所述至少一种引物仅在其高解链温度下结合的引物退火温度的循环。