[发明专利]分析牙斑的方法

说明书

发明领域

本发明涉及使用毛细管电泳(capillary electrophoresis)在斑中检测氨、钙和酸的方法。

发明背景

在龋齿的初始发展中，口腔中的某些细菌代谢糖以制备有机酸作为产物。这些有机酸中的一些包括甲酸、琥珀酸、丁酸、丙酸、乙酸和乳酸。这种生酸的细菌(acidogenic bacteria)接近牙齿表面，并且酸与表面接触，最终引起牙釉质破坏或去矿化。这种产生的频率和与牙釉质接触得越长，最终发展成为龋齿损害的去矿化的程度越大。在斑暴露于蔗糖挑战之后，乳酸特别提高，并且已显示为使牙齿去矿化产生的更多有害的酸之一。

然而，不是口腔中的所有细菌都是生龋的或破坏性的。在口中生物群落(bioflora)的类型通常在发展洞和口腔健康中起到显著的作用。例如，已提出精氨酸和其它碱性氨基酸用于口腔护理，并且相信在抗击洞形成和牙齿灵敏度中具有显著的益处。已推测精氨酸的有益作用的显著因素在于精氨酸和其它碱性氨基酸可被某些类型的细菌，例如，血链球菌(S. sanguis)代谢，它们不生龋并且与生龋的细菌例如变形链球菌(S. mutans)竞争在牙齿上和在口腔中的位置。分解精氨酸的细菌(arginolytic bacteria)可使用精氨酸和其它碱性氨基酸来产生氨，从而提高它们的环境的pH，而生龋的细菌代谢糖以产生乳酸，其倾向于降低斑pH和使牙齿去矿化，最终导致洞。

在开发新的组合物和用于口腔护理的方法中，可期望集中于抑制、破坏或特别是阻碍引起破坏的那些细菌，而不是简单地使用杀灭所有细菌的方法，和/或集中于中和或分散具有破坏性的酸的方法。

毛细管电泳(例如毛细管区域电泳)通过电荷、摩擦力和流体动力学半径分离各离子种类。在传统的电泳中，在电场的影响下，带电荷的分析物在传导性液体介质中移动。在填充电解质的小的毛细管的内部，毛细管电泳基于它们的尺寸与电荷比率来分离离子。

毛细管电泳已用于测量斑中的酸。参见，例如，Damen J.J.M.等，Caries Research (2002) 36：53-57。WO 2009/100262 (通过引用结合到本文中)公开了监测斑中的酸和氨二者，但是由血浆诊断试剂盒改编的用于测量氨的方法耗时，耗时约一周来完成。该方法也不适合高处理量使用。

因此，在研究斑形成和牙齿腐烂中，和在开发用于口腔护理的新的组合物和方法中，有用的是具有一种简单、快速、容易使用的方法来测量氨产生和任选斑的酸化，其可允许人们评价在斑中有益的和任选还生龋的细菌的存在和活动，以及评价患者的疾病状态，和口腔护理组合物和方法的有效性。此外，具有更有效的方式来监测口中生物群落(bioflora)的类型，例如，以确定最优治疗和监测治疗的有效性将是有用的。

发明概述

本发明提供了一种用于测量斑样品中的氨和/或钙和任选的酸的简单的、容易使用的方法。在开发改进的口腔护理产品和方法以及诊断和治疗方法中，所述方法可用于高处理量使用。所述方法包括得到斑样品和使用毛细管电泳测量氨和/或钙和任选的酸。例如，在一个实施方案中，所述方法(方法1)包括以下步骤：

a. 得到斑样品；

b. 用水稀释样品；

c. 加热样品至例如足以杀灭细菌和释放离子进入溶液中；

d. 分离样品的液体部分，例如使用离心和/或过滤；

e. 将液体部分与以下试剂合并：

　　i. 允许镁离子与钙离子电泳分离的试剂，例如羟基异丁酸，

　　ii. 允许钾离子与铵离子电泳分离的试剂，例如18冠6醚，

　　iii. 包含碱性试剂(例如，咪唑)和酸性试剂的缓冲剂，其可任选与络合剂i或ii中的一个(例如，羟基异丁酸)相同，例如，缓冲液体至约pH 4-5，例如约pH 4.3；

f. 使步骤e的产物通过毛细管，其中在毛细管的一端和另一端之间存在电位，所述电位足以诱导离子通过管的电泳流动；

g. 在已通过至少一部分毛细管的液体中检测铵离子和/或钙离子，例如，使用紫外或紫外-可见吸光度、质谱、表面增强的拉曼光谱学或其它检测手段。

因此，方法1包括以下方法：

1.1. 方法1，其中在步骤a中，斑得自人患者；

1.2. 方法1或1.1，其中在步骤b中，将斑稀释至约0.01-0.1 mg斑/mL水的浓度，例如，约0.03-0.04 mg斑/ml水；