[发明专利]产生单克隆植物细胞系的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。具体而言，本发明涉及通过流式细胞分选由植物细胞的异质性群体产生天然（野生型）或转基因单克隆植物细胞系。对于本领域技术人员而言明显的是，本发明也包含使用该单克隆植物细胞系再生整株可育性植株。

背景技术

在过去数十年间，已将许多工作投注于建立并培养以植物为基础的系统，以用于积聚和获取天然或异种蛋白质与次级代谢产物。文献提供了大量的证据性材料来证明以植物为基础的系统的实用性，即、生产多种所希望的物质，该物质被分泌至培养基或从生产细胞、组织、细胞器或甚至于整株植物或其部分分离。同样地，存在有广泛的确保建立稳定或暂时转化的植物材料的转化实验报告（transformation protocol）。但是，还需要可靠、相对低成本并且快速的技术，以从植物细胞获得高产量的所要产物。

已重复报导，植物细胞群（诸如植物悬浮培养物）的转化通常会产生转基因培养物，该培养物显示细胞具有高度异质性（混合型）与目标蛋白质表达水平不一致，所述目标蛋白质与初级异质性细胞群中的表观基因不同的细胞混合物有关。在重组细胞系中，转基因表达的异质性证实生产率方面的严重问题。

主要问题为在转化试验中通常罕见高产克隆，而且要建立同源性高产细胞系相当耗时。因此，仍存在着的技术挑战为从刚转化或已转化的转基因植物培养物中生产与回收优异的转基因产物。

关于流式细胞分选（flow cytometric sorting）（诸如FACS（荧光激活细胞分选）应用），必须通过细胞的酶消化而释放出原生质体，从而自通常聚集在一起的植物细胞群或培养物取得单一球形细胞。但是，对于大部分的植物品种来说，单一原生质体的再生会受限于必须维持某一群体密度。

迄今，并未描述过一种用于再生单一转基因细胞/原生质体或用于自其（特别是在流式细胞分选之后）再生完整可育性植株的可靠且可再现的工序。

发明内容

因此，本发明主要是涉及提供一种以植物为基础的系统，其利用由植物细胞的异质性（混合型）群体（诸如悬浮培养物）产生的未转化或转基因的单克隆植物细胞系，以产生高水平的所期望的天然或重组产物，并且克服现有技术的问题，尤其是关于快速分离以及接下来再生单一（转基因）原生质体，直到形成可用来建立单克隆植物细胞系的小集落（microcolony），所述单克隆植物细胞系优选能够生产并积聚大量的期望产物。对于本领域技术人员而言清楚的是，本发明同样提供由已建立的单克隆植物细胞系再生而来的完整可育性植株。

相对于许多目前使用及开发的基于使用完整植株或至少完整并已分化的植物组织的系统，使用悬浮细胞的优势在于，同源性材料在受控、无菌与所限制的条件下可再现地生产。

在植物中，目前有两种主要的生产重组蛋白质的策略，即：（i）产生稳定的转基因植物或悬浮细胞系；或（ii）在用细菌（例如土壤杆菌）、病毒（例如烟草镶嵌病毒、马铃薯病毒X/Y、豇豆花叶病毒与许多其他病毒）或两者组合（例如优化的侵染（magnifection））侵染植物表达宿主（植物、组织或细胞），使得宿主能够表达异种遗传信息（DNA或RNA）后，异质性基因瞬时表达。另外且为本领域技术人员所公知，基因信息亦可通过已建立的机械方法（例如电穿孔或激光打孔）而引入植物表达宿主。

尽管本发明优选涉及被稳定转化的植物细胞材料的应用，但是本发明方法中也可以涉及用于瞬时表达的系统，其具有快速优势（基因产物、上市时间、紧急反应）以及达到比稳定转化的转基因植物或其部分（诸如细胞）高得多的积聚水平的可能性。

依据本发明，提供一种由植物细胞的异质性群体产生天然（野生型、非转化）或转基因单克隆植物细胞系的方法。该方法包括：首先提供该植物细胞群，例如形成源植物细胞（source plant cell）材料的植物悬浮细胞，所述源植物细胞材料可进行如本发明的方法所包括的后续步骤。通常，此植物细胞材料可容易地来源于例如异质性植物悬浮培养物，该培养物优选在受控及/或无菌条件下培养。源细胞可以是（稳定地/瞬时地）转化的转基因细胞或野生型（天然、未经转化）细胞，其能够生产并积聚期望产物。