[发明专利]用于改变物质温度的系统和方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种可用于快速改变某些物质温度的系统。其应用之一是在核酸扩增技术的领域，例如聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)。 

背景技术

在分子生物学中，核酸扩增技术（例如PCR（聚合酶链式反应））是用于扩增RNA或DNA的短多核苷酸序列（高达1000个核苷酸，但偶尔更长，达10,000个核苷酸或甚至更长）。凯利穆利斯（Kary Mullis）已经在1989年第一次进行了PCR过程。

典型地，在此过程中，首先将一个双链DNA模板加热到第一、变性温度（其中DNA变性）；即DNA的双螺旋结构解旋并且其多核苷酸链分开。通常，第一温度为367-369开尔文。视DNA模板序列而定，可以使用更低或更高的温度。

在下一步骤中，温度降低到第二、退火温度，其中引物（合成的或非合成的DNA的短、特异性序列，通常20个碱基长，尽管引物可以被认为有必要更长或更短）可以退火结合到变性的、单链模板。通常，第二温度是在321-343开尔文的范围内，更优选地是331-335开尔文，尽管视所使用的引物而定可以使用更高以及更低的温度。

在第三步骤中，温度变成第三、最佳、延伸温度，通常为345-347开尔文，尽管可以使用更高以及更低的温度，其中一种聚合酶（优选地为一种热稳定酶）将通过与单链模板的核苷酸互补的核苷酸对引物进行延伸。

随后重复所述过程，即将混合物恢复到变性温度。人们称此过程为热循环。虽然可以使用更高以及更低的循环计数，但通常使用30个循环进行一个PCR反应。

在已知的实施例（其可以同样地应用于本发明）中，可以施用一个逐级降低PCR过程，其中退火温度在预定数目的循环后逐步略微地降低。

对于使用具有较高熔化温度（接近于延伸温度）的引物的反应，可以使用一种省略第二、退火温度作用的两步循环：退火和延伸合并于单一步骤中。所述反应通常在称为“艾本德管（eppendorf tube）”的反应容器或具有96或384孔的反应板中进行。板和管通常是由聚丙烯制成。发现其它塑料制品可以是合适的。其它形式（例如玻璃管）是可能的。

PCR过程的持续时间取决于反应的速度以及温度变化（热循环）的速度和精确性。多年来已经提出了多个用以进行热循环的方法并且其中多个已经投入实践。

- 已经通过手动地将反应管从一种恒温水浴转变到下一个恒温水浴来进行第一PCR反应，同时对所有的步骤计时。所述过程适用于第一实验中，但繁琐并且耗时。

- 第一自动热循环仪使用加热单元来加热安放反应管的铝块。使用水来冷却这些块体。这些第一机器在大约4小时内进行PCR。

- 下一代使用珀尔帖元件（Peltier element）来加热和冷却这些块体。这些机器产生高达5 K/s的温度瞬变。冷却较慢：最大为-4.5 K/s。PCR可以在2到4小时之间进行。存在更快的机器（应用生物系统（Applied Bio Systems）、Stratagene公司的罗博循环仪（Stratagene RoboCycler）、赛默飞世尔公司的匹克循环仪（ThermoFischer PikoCycler））。罗博循环仪使用机械手将板从一个温度块移动到下一个温度块。应用生物系统和匹克循环仪使用快速的温度倾斜上升（5 K/s和-4.5 K/s）；匹克循环仪使用具有更薄壁（平均150 ??m）的反应容器。由于管中液体温度的滞后，所有这些或多或少地在速度上受到阻碍。

- 更快的机器（爱达荷技术公司的罗氏轻循环仪（Roche light cycler，Idaho Technology））使用恒温空气来控制玻璃管中PCR混合物的温度。在加热期间温度瞬变可以达到17 K/s，但冷却则取决于环境温度。PCR可以在30分钟内进行并且某些情况下在20分钟内进行。通常地，一个反应仍然需要大约1小时。

- 已经对通过在试管中混合物的内部产生温度梯度来改变温度进行了尝试。对流随后将占领混合物，其成分自动地通过连续温阶。近来，已经通过在一个斜率下产生温度梯度来改良此系统，以便产生更佳的对流。

- 已经设计泵系统用以在由例如PTFE制成的管内部将混合物泵送通过不同温度区（这些温度区在空间上是分开的）。

- 芯片PCR依靠将极少量的混合物（即不超过几个纳米公升的液滴）移动到已经形成的温度区中。如果DNA已经被磁性珠粒标记，那么可以通过泵送或通过磁场来进行移动。