[发明专利]用于通过同源重组转化和选择酵母转化体的盒和方法

权利要求书

1.一种用于选择转化酵母细胞的方法，所述酵母细胞具有通过同源重组整合于载体中的目的核酸片段，所述方法包括以下步骤：

(i)使酵母细胞与以下物质相接触：

-包含以下的载体：

○正选择基因，

○包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，和

-待通过同源重组插入所述载体的所述同源重组位点中的目的核酸片段，所述核酸片段的侧翼是与所述同源重组位点的所述5’和3’重组区基本相同的区域；以及

(ii)用所述载体和所述目的核酸片段转化所述酵母细胞；

(iii)选择含有带所述正选择基因之所述载体的酵母细胞，

其特征在于：

-负选择基因也存在于所述载体中所述同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制，所述启动子与负选择基因在所述目的DNA片段插入之前在所述载体中可操作地连接；以及

(iv)所述方法还包括使用所述负选择基因选择带有所述目的DNA片段的酵母细胞的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括通过将盒整合到包含：

-正选择基因，和

-启动子

的载体中从而得到本发明载体的早先步骤，所述盒包含：

-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，和

-在所述同源重组位点下游的负选择基因，

从而使位于所述盒之所述同源重组位点下游的所述负选择基因受所述载体中存在的所述启动子控制，所述启动子与所述负选择基因在所得载体中可操作地连接。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，所述方法包括合成目的核酸片段的更早先步骤，所述片段包含待研究或待生产的核酸序列，其侧翼是与步骤(i)的所述载体上同源重组位点的5’和3’区基本相同的序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述负选择基因是URA3基因。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中控制所述负选择基因表达的所述启动子是GAL1。

6.根据权利要求4和5所述的方法，其中：

-所述负选择基因URA3受诱导型启动子(在非诱导型培养基中有渗漏表达)优选GAL-1启动子控制，并且

-通过同源重组插入本发明的所述目的核酸片段使得所述负选择基因与其启动子隔开至少120个碱基对，最优选至少188个碱基对。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中控制所述负选择基因表达的所述启动子是ADH1。

8.根据权利要求4和7所述的方法，其中：

-所述负选择基因URA3受ADH-1启动子控制，并且

-通过同源重组插入本发明的所述目的核酸片段使得所述负选择基因与其启动子隔开至少100个碱基对，最优选至少169个碱基对。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中同时实现选择步骤(iii)和(iv)。

10.一种盒，其包含：

-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，和

-存在于所述同源重组位点下游的负选择基因。

11.根据权利要求10所述的盒，其中所述负选择基因是URA3基因。

12.一种载体，其包含：

-复制起点，

-正选择基因，所述正选择受启动子控制，

-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点，以及

-负选择基因，其存在于所述载体中所述同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制，所述启动子与负选择基因在目的DNA片段插入之前在所述载体中可操作地连接并且受终止子控制。

13.一种得到如权利要求12所限定的载体的方法，所述方法包括将根据权利要求10至11中任一项所述的盒整合到包含：

-正选择基因，和

-启动子

的载体中，

从而使位于所述盒所述同源重组位点下游的所述负选择基因受所述载体中所存在的所述启动子控制，所述启动子与所述负选择基因在所得载体中可操作地连接。