[发明专利]制备间充质干细胞基础培养基和利用间充质干细胞基础培养基制备细胞治疗产品的方法及用该培养基得到的分化产品

权利要求书

1.一种间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于，该方法包括：

在分析商业化培养基组分的类型后组合2种以上的培养基以制备一系列候选的各种基础培养基；

通过使用候选的基础培养基中的间充质干细胞，分析存在于完全培养基中的间充质干细胞的增殖率，所述完全培养基含有10%-20%的胎牛血清；以及

筛选适合于间充质干细胞早期培养的基础培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，将商业化的培养基DMEM高葡萄糖、RPMI-1640和Ham’s F-12以1:1:1的比例混合得到的所述基础培养基，分别与DMEM高葡萄糖、RPMI-1640和Ham’s F-12的每种培养基比较，对于在每种培养基中与DMEM高葡萄糖培养基组分相重叠的组分，选择其较高的浓度，如果一种组分不是DMEM高葡萄糖的一部分，则将该组分包含在DMEM高葡萄糖培养基中，如果一种组分仅包含在每种培养基中，保持该组分相同的浓度，如果一种组分不是DMEM高葡萄糖的一部分，则将该组分包含在DMEM高葡萄糖培养基中，对于含有相同来源的每种培养基的组分，选择单一的组分，如果选择的组分出现在其他的培养基中，选择其较高的浓度，以及如果一种组分不是DMEM高葡萄糖培养基的一部分，则将该组分包含在DMEM高葡萄糖培养基中，其表现出高等基础培养基-间充质干细胞（ABM-M）的特征。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，作为DMEM高葡萄糖培养基的部分的组分，含有包括L-丙氨酸、无水L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-羟基-L-脯氨酸和L-脯氨酸的氨基酸，包括五水硫酸铜、七水硫酸亚铁、无水磷酸氢二钠和七水硫酸锌的无机盐，包括D-生物素、对氨基苯甲酸（PABA）和维生素B12的维生素，次黄嘌呤，减少的L-谷胱甘肽，亚油酸，腐胺+2HCL，硫辛酸以及胸苷，其表现出高等基础培养基-间充质干细胞的特征。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，作为高等基础培养基-间充质干细胞的ABM-M培养基包括选自胚胎，小牛，马或人，L-谷氨酰胺，抗生素和抗真菌中的至少一种。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，在ABM-M中，高等基础培养基-间充质干细胞含有多于10-20％的胎牛血清和2-4mM的L-谷氨酰胺。

6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述组分选自包括L-精氨酸单盐酸盐、L-天冬氨酸、L-胱氨酸二盐酸盐和一水L-组氨酸单盐酸盐的氨基酸，包括二水氯化钙、硫酸亚铁、无水硫酸镁和无水磷酸氢二钠的无机盐，和包括盐酸吡哆醛的维生素，所述组分表现出高等基础培养基-间充质干细胞的特征。

7.根据权利要求2所述的方法，其中，ABM-M培养基表达CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、CD73和HLA-ABC的80％以上的阳性表面标记物，其中，CD44、CD105、CD90、CD74和CD166的阳性表面标记物的表达在95％以上，且CD14、CD31、CD34、CD45、CD80和HLA-DR的阴性表面标记物的表达少于5％，ABM-M培养基表现出高等基础培养基-间充质干细胞的特征。

8.根据权利要求2所述的方法，其中，ABM-M培养基表达CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、CD73和HLA-ABC的80％以上的阳性表面标记物，其中，CD44、CD105、CD90、CD74和CD166的阳性表面标记物的表达在95％以上，且CD14、CD31、CD34、CD45、CD80和HLA-DR的阴性表面标记物的表达少于5％，其表现出高等基础培养基-间充质干细胞的特征。

9.根据权利要求2所述的方法，其中，所述间充质干细胞在ABM-M（作为高等基础培养基-间充质干细胞）培养基中培养，并在含有地塞米松、抗坏血酸、丙酮酸钠、TGF-β和BMP-2的DMEM低葡萄糖培养基中分化，作为用于骨关节炎的细胞治疗产品的间充质干细胞分化成软骨细胞。

10.根据权利要求2所述的方法，其中，所述间充质干细胞在ABM-M（作为高等基础培养基-间充质干细胞）培养基中培养，并在含有胎牛血清、地塞米松、吲哚美辛和胰岛素的α-MEM培养基中培养和分化，其稍后分化成脂肪细胞，间充质干细胞作为用于形成脂肪组织的细胞治疗产品。