[发明专利]分子检测测定

说明书

技术领域

本发明涉及用于处理样品以进行分子检测测定，特别是处理临床样品以进行核酸检测测定以检测疾病的方法。

发明背景

人的分子测试已经对医疗诊断和患者管理变得越来越重要。动物的分子测试在兽医应用中日渐重要。核酸测试是现代法医学、移民、亲子鉴定和其它人身份应用的必需工具。实验胚胎学对癌症研究、鉴定生物标志、素质因素和潜在药物靶标变得越来越重要。RNA基因分型涵盖研究、应用测试和诊断学的所有领域中一系列用于分析个体或细胞之间遗传差异的应用。处理生物样品时，目前的分子测试需要在用例如聚合酶链式反应(PCR)等技术进行核酸检测之前，对样品进行特定预处理。目前认为样品预处理是必需的并且已经开发了许多商业试剂盒和系统并且正用于市场中。不幸的是，预处理增加了分子测试的成本并且需要额外处理时间和设备。

人类遗传标记控股有限公司(Human Genetic Signatures Pty Ltd)(悉尼，澳大利亚)已经开发了如WO2006/058393和US7833942中所公开的用于检测微生物的方法。所述方法包括用一种试剂处理微生物的微生物核酸以形成源自微生物核酸的简化形式的核酸，所述微生物核酸具有可用于检测微生物的独特核酸序列。

本发明人已经开发了不需要如同分子检测测定中目前所需要的样品预处理的改进的分子检测测定。

发明概述

本发明涉及对生物样品进行的分子检测测定，其不需要样品清除步骤或处理生物样品以溶解细胞或纯化核酸。

在第一方面，本发明提供了一种分子检测测定，包括：

(a)在容许细胞破碎和核酸处理的条件下直接用亚硫酸氢盐试剂处理生物样品；

(b)从所述经处理的样品中去除所述亚硫酸氢盐试剂；并且

(c)检测所述经处理的样品中的靶核酸。

在步骤(a)之前，所述生物样品不需要细胞破碎或化学/物理处理。

所述生物样品可选自粪便、鼻腔、血液、血浆、血清、口腔细胞、脓液、伤口、浓缩滤液、脑脊髓液、精液、液基细胞学(LBC)、组织、FFPE、激光捕获细胞、培养细胞、沉淀细胞、细菌培养物、细菌菌落、病毒悬液、抽吸物、支气管灌洗、痰液样品、环境样品、环境浓缩物、粮食、原料、水样或水浓缩物等。

检测到的核酸可为DNA、RNA或DNA和RNA的组合。

所述测定适合于检测动物的传染病、遗传性疾病或遗传特性。优选地，所述动物为人。

所述传染病可由微生物引起，所述微生物包括细菌、病毒、类病毒、酵母菌、真菌、朊病毒、寄生虫或变形虫。

所述遗传性疾病可为癌症、突变、拷贝数改变、遗传病症、环境诱导的疾病、由暴露于致癌物引起的疾病、特征在于基因组中核苷酸重复长度扩大或减小的疾病。

遗传特性可为对癌症或任何其它疾病的易感性，其中遗传和表观遗传变化促成疾病状态的发展。

优选地，亚硫酸氢盐试剂为亚硫酸氢钠或偏亚硫酸钠。优选地，以浓度为约2.5M至约3.5M，pH范围为约4.5至约5.5使用亚硫酸氢盐试剂。更优选地，以浓度为约3M，pH为约5.0使用亚硫酸氢盐试剂。

优选地，步骤(a)包括在约75℃和95℃之间加热约1分钟至30分钟。更优选地，在约80℃和95℃之间的温度下加热所述样品约10至20分钟。应了解，温度和加热持续时间可根据处理的样品和待检测核酸的细胞来源而改变。

可通过任何适合方式从经处理的样品中去除亚硫酸氢盐。实例包括基于柱的纯化或基于珠粒的纯化最佳，但是在一些情况下简单的沉淀步骤可能已足够。

去除亚硫酸氢盐之后，优选地使所述样品再悬浮于pH为至少10，更优选介于约pH11.5至约12.5的洗脱缓冲液中。已经发现至少为约12的pH适合大多数样品。

亚硫酸氢盐试剂将经处理的核酸中的胞嘧啶修饰为尿嘧啶。在双链DNA中，亚硫酸氢盐试剂将互补双链基因组DNA的每条链中的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，形成除非互补核酸分子外的两种衍生物。

在一种优选的形式中，衍生微生物核酸大体上含有碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)并且具有与相应的未经处理的核酸大体上相同的碱基总数。

如果扩增经处理的核酸，则扩增的核酸大体上含有碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。可通过任何适合方式例如聚合酶链式反应(PCR)、恒温扩增或信号放大进行扩增。

在一种优选的形式中，所述测定进一步包括为经处理的样品提供核酸引物或探针。