[发明专利]常山酮分子印迹固相萃取小柱的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体是常山酮分子印迹固相萃取小柱的制备方法及其在动物性食品中残留分析时样品的纯化和富集。

背景技术

常山酮是从我国中药常山中提取出的常山碱的衍生物，是一种广谱抗寄生虫药，对鸡的柔嫰、毒害、堆型、变位、巨型和布氏艾美耳球虫均有效，对球虫的子孢子、第一代和第二代裂殖体均有明显的抑杀作用；对大多数革兰氏阳性菌也有效，且无交叉耐药性。常山酮氢溴酸盐作为一种饲料添加剂广泛用于防治家禽的球虫病。在我国，氢溴酸常山酮被允许以3 mg/kg的浓度添加在饲料里，其休药期为4天。为了避免常山酮的残留，许多国家建立了其残留检测方法并对其残留限量作了规定。我国农业部235公告中规定常山酮在牛肌肉、皮/脂、肝和肾组织中的最高残留限量分别为10μg/kg、25μg/kg、30μg/kg和30μg/kg，在鸡/火鸡的肌肉、皮/脂和肝组织中的最高残留限量分别为100μg/kg、100μg/kg和130μg/kg。

常山酮在动物组织中的残留对人类健康和环境生态均有潜在的危害。美国农业部食品安全监督署已将该药列入国家残留检测计划，定期对其残留进行监控。目前，常山酮残留的检测方法中的仪器方法主要为高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法，其检测能力虽然较强，但检测方法和样品的前处理繁琐、费时、费力、影响因素众多。基于各类生物性抗体的免疫分析技术需要制备结合抗原和有特异性识别作用的抗体，制备过程较为复杂，同时分析过程中的稳定性较差，精密度较低。 

    固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）是近年来迅速发展起来的专门用于样品纯化和浓缩的一项技术，被广泛应用于多种复杂样品的前处理过程中。与液液萃取相比，SPE可以更有效地将分析物与干扰物分离，减少样品前处理过程，使操作更加简便、高效、省时、省力。SPE处理的效果很大程度上依赖于其填料的种类，已有的填料包括活性炭、硅胶和氧化铝等，这些传统填料中吸附剂与目标分子之间主要依靠一些非特异性的分子间作用力而进行相关物质的吸附。分子印迹技术作为一种能够获得在空间和结合位点上与某种分子完全匹配的聚合物制备技术，具有构效的预定性、识别的特异性和广泛的实用性。基于分子印迹聚合物的固相萃取柱既具有对靶分子的特异性识别作用，又具有较好的稳定性，能够耐极端环境，制备简便，成本廉价。将分子印迹聚合物用于待测物质的选择性吸附和富集较其他方法具有更为明显的优势，已经展现出诱人的开发和应用前景。

本发明采用氧化还原引发剂低温引发制备常山酮的分子印迹聚合物微球，所制备的微球经漂洗、过筛、干燥和洗脱等一系列处理后，再通过紫外分光光度法对其进行评价分析即可得到高效识别性能的聚合物材料。

发明内容

本发明的目的在于克服现有固相萃取方法的不足，提出一种常山酮分子印迹固相萃取小柱的制备方法及其在动物性食品中常山酮残留分析中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种常山酮分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其步骤如下：

1）先将聚乙烯醇400加入蒸馏水中，加热至95℃使其溶解，形成浓度为3%-8%聚乙烯醇400溶液（优选为4%-6%），冷却至室温，然后转至三口烧瓶中；

2）将模板分子溶解于致孔剂中，加入功能单体，得到混合溶液；所述的模板分子为常山酮，致孔剂为乙腈，功能单体为甲基丙烯酸、丙稀酰胺、4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酸酯中的一种或两种的组合；所述的模板分子和功能单体的摩尔比为1:3-6，模板分子在致孔剂中的摩尔浓度为2.5mmol/L-5mmol/L； 

3）将步骤2）的混合溶液用超声清洗仪超声5min，混合均匀，放入4℃冰箱孵育24h，得到预聚合体系；

4）将步骤3）的预聚合体系置于冰水浴中，加入交联剂和引发剂，然后用超声清洗仪超声5min，通入氮气5min，并在氮气气氛或真空状态下密封；所述的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯，作为优选该交联剂是三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，加入量为功能单体摩尔量的5倍，所述的引发剂是等摩尔比的过氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺，加入量为功能单体摩尔量的0.2倍； 

5）将步骤4）的反应体系在搅拌和氮气保护下慢慢滴加到步骤1）的三口烧瓶中引发聚合，引发温度为10℃-30℃，聚合时间为6h-36h（优选的引发温度为18℃-25℃，聚合时间为12h-24h）使其形成乳白色的微悬浮乳液，即为印迹聚合物；