[发明专利]一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR1基因表达的方法

权利要求书

1. 一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR1基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异性上下游引物：TLR1-q-F：5'- TCCGCACTTCTCATCTTTAT -3'；TLR1-q-R：5'- ATTTCACCACAGCCCTTC -3'；

以及作为内参基因的牙鲆β-actin基因特异性上下游引物：β-actin-F：5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3';β-actin-R：5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'。

2.一种采用权利要求1所述的特异性引物快速检测牙鲆TLR1基因的方法，其特征在于按如下步骤：

（1）使用下述引物进行该基因的检测：

符合荧光PCR反应特点的该序列特异性上下游引物：

TLR1-q-F：5'- TCCGCACTTCTCATCTTTAT -3'

TLR1-q-R：5'- ATTTCACCACAGCCCTTC -3'

以及作为内参基因的牙鲆β-actin特异性上下游引物：

β-actin-F：5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3'

β-actin-R：5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'；

（2）总RNA提取与纯化：采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从牙鲆头肾中提取得到纯化的牙鲆头肾总RNA；

（3）cDNA第一链合成：以牙鲆头肾总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20μL；

（4）实时荧光PCR：以上述合成的cDNA第一链为模板，上述（1）中TLR1-q-F和TLR1-q-R、β-actin-F和β-actin-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反映，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数；

实时荧光PCR扩增体系设置如下：

Components每管成分Volume体积(μL)Hotstart Fluc-PCR mix 热启动荧光PCR混合物25Sense primer正向引物 (25 pmol/μL)1Anti-sense primer反向引物 (25 pmol/μL)1cDNA第一链 (μL)3ddH₂O (μL)20Total Volume总体积 (μL)50；

实时荧光PCR扩增参数设置如下：

94℃ 4 min ；

94℃ 30 s；60℃ 30 s；72℃ 30 s (40个循环)；

72℃ 10 min；12℃保温；

（5）牙鲆头肾组织中TLR1基因的相对表达量计算：实时荧光PCR完成后，根据Ct值计算牙鲆病原感染各时间段下的△Ct、2^-(ΔΔCt)值，计算方式如下： 

△Ct = Ct — Ct内对照（β-actin）

△△Ct =△ Ct —△Ct（0时健康牙鲆）

以2^-(ΔΔCt) 数值表示牙鲆头肾中TLR1基因相对于健康牙鲆TLR1基因的表达量。

3.如权利要求2所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为25 μmol/L的贮存液，工作浓度为0.5 μmol/L。