[发明专利]一种C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸及其乙酯的生产方法

权利要求书

1.一种C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸及其乙酯的生产方法，其特征在于，包括：

步骤1、分别将萼距花属植物/月桂树/香樟中来自脂酰酰基转运蛋白硫酯酶(FAT)家族中具有不同特异性硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至原核表达载体，得到重组质粒转至BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达生产中链脂肪酸。

步骤2、再将不动杆菌中高度非特异性的双功能蜡酯合成酶/酰基辅酶A二酰甘油酰基转移酶基因atfA分别克隆至已连接硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB的原核表达载体，得到重组质粒转至BL21(DE3)中，经外源性流加乙醇与IPTG诱导表达后生产中链脂肪酸乙醇酯。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所表达的来自萼距花属植物/月桂树/香樟中FAT家族硫酯酶可特异性水解特定链长的脂酰ACP，分别得到C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所表达的来自不动杆菌中高度非特异性的双功能蜡酯合成酶/酰基辅酶A二酰甘油酰基转移酶可催化外源性流加的乙醇(1％-5％)与胞内形成的中链脂酰-CoA发生酰基转移反应合成特定的C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸乙醇酯。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述chFatB/ucFatB/ccFatB基因克隆至双启动子原核表达载体pETDuet-1，得到重组质粒pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB。其中硫酯酶基因置于T₇promoter 2下游，由T₇启动子驱动表达。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述atfA基因克隆至双启动子原核表达载体pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB，得到重组质粒pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA。其中酰基转移酶基因置于T₇promoter 1下游，由T₇启动子驱动表达。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，已转入重组质粒pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB的重组大肠杆菌，经添加0.2-0.48mM IPTG诱导硫酯酶表达后，可特异性水解特定链长的脂酰ACP，分别得到C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸，其中pETDuet-chFatB重组大肠杆菌所产C8:0和C10:0脂肪酸所占比例为：5.42％与12.6％；pETDuet-ucFatB重组大肠杆菌所产C12:0脂肪酸所占比例为：34.52％；pETDuet-ccFatB重组大肠杆菌所产C14:0脂肪酸所占比例为：32.21％。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，已转入重组质粒pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA的重组大肠杆菌，经添加0.2-0.48mM IPTG诱导硫酯酶和酰基转移酶表达与外源性流加1％-5％乙醇后，可催化乙醇与相应的中链脂酰-CoA发生酰基转移反应合成特定的C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸乙醇酯。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述的来自萼距花属植物/月桂树/香樟中FAT家族硫酯酶的核酸序列如序列1/3/5所示，各自所编码氨基酸序列如序列2/4/6所示。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述来自不动杆菌中高度非特异性的双功能蜡酯合成酶/酰基辅酶A二酰甘油酰基转移酶的核酸序列如序列7所示，所编码氨基酸序列如序列8所示。