[发明专利]一种淋球菌免疫抑制突变基因ΔopaI及其突变方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种淋球菌免疫抑制突变基因及突变方法。

背景技术

淋球菌的天然宿主是人类，感染后导致性传播疾病淋病，可引起一系列病变，包括局部感染（如尿道炎、副睾炎、宫颈炎，输卵管炎等）和全身播散性感染。输卵管、盆腔等部位的病变可导致不孕症或宫外孕等严重后遗症。淋病患者还大大增加了艾滋病的发病机会。淋病发病率高，全球每年新发病例约6200万。越来越严重的淋球菌耐药性现象给淋病治疗带来了越来越大的困难。因此，研制有效的疫苗是淋病防制工作中的重点方向之一。

淋球菌疫苗研制历经艰难，二十世纪七十年代全细胞疫苗的人体试验遭遇失败，研究的重点开始转向亚单位疫苗和基因疫苗等新型疫苗。菌毛是第一个被纯化的淋球菌亚单位成分，尽管纯化后的菌毛能够刺激机体产生较高滴度的抗体，但是由于菌毛表面一些表位变异程度高，这些抗体并不具有显著的免疫保护作用。同样由于高度变异的原因，另一类重要粘附因子Opa蛋白在淋病疫苗研制中也受到了限制。孔蛋白是持续表达在淋球菌表面的Ⅰ型外膜蛋白，具有免疫原性强、抗原相对保守等特点。90年代初期曾用覆盖多数血清型的porin疫苗进行动物免疫实验，效果并不十分理想。随着基因工程技术的迅速发展，用基因工程技术表达淋球菌抗原成为研制淋病疫苗的重要方向。人们已经成功表达了多种淋球菌抗原，如Porin、NspA、TbpA、TbpB、LOS等，用蛋白质相关技术进行纯化和复性，配合一定佐剂免疫小鼠，发现在小鼠体内均可以诱导产生特异性保护抗体。

从目前的淋球菌疫苗的研究现状分析，只用一种抗原的淋球菌疫苗完全预防淋球菌感染是非常困难的。尽管这种疫苗可以产生一定的保护力，但是，如果这种接种只是使淋球菌感染转为无症状型，感染者因而不就医，那反而会增加淋球菌的传播。因此，含有更多甚至全部淋球菌保护性抗原的疫苗是最理想的淋病疫苗候选。本发明提供了一种突变淋球菌免疫抑制基因的有效方法，突变株不能表达淋球菌免疫抑制基因，解除淋球菌感染后对机体造成的免疫抑制，在淋病新型疫苗研制中具有重要意义。

发明内容

野生型淋球菌中含有免疫抑制基因opaI，该基因的产物蛋白OpaI可抑制机体免疫系统产生对病菌的抵抗力。本发明提供了一种突变opaI的方法及突变基因，从而消除了淋球菌的免疫抑制作用，突变菌株进入机体后可刺激产生正常的免疫应答反应，解决了研制淋球菌全细胞疫苗的瓶颈问题。

本发明所述的突变免疫抑制基因ΔopaI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明所述的突变免疫抑制基因ΔopaI通过以下方法获得：以淋球菌基因组DNA为模板，PCR扩增opaI基因上游和下游侧翼区DNA片段，二者之间插入卡那霉素抗性基因Kanr，得到的突变基因ΔopaI。

将上述突变基因ΔopaI克隆至自杀质粒pGMB151，携带重组自杀质粒的大肠杆菌与淋球菌共孵育使质粒转入淋球菌细胞。自杀质粒带有的SacB基因可诱导细菌脱去质粒并与野生型opaI发生同源重组，从而得到opaI- 突变株。

本发明所述的突变方法，包括如下步骤：

（1）opaI基因的克隆：以淋球菌基因组DNA为模板，以 SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列为引物通过PCR扩增出如SEQ ID NO.3所示淋球菌opaI基因；

（2）opaI上下游两侧侧翼区的扩增;将上述：以上述（1）opaI基因扩增产物与T载体pMD-19连接，并以连接产物为模板，以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引物，扩增得到包含opaI基因两侧侧翼区的一个线性片段SEQ ID NO.6；

（3）以质粒pET-28a(+)为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物扩增得到Kanr基因序列SEQ ID NO.9；

（4）opaI基因的插入突变