[发明专利]一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法

权利要求书

1.一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于包括如下步骤：

①种子的消毒：取健康饱满大豆种子，放入含有100ml 30％次氯酸钠和4ml浓盐酸的密闭容器内，利用反应生成的氯气消毒24～36小时；

②种子的萌发培养：将步骤①中的种子接种到B₅萌苗培养基中进行为期5～6天的25℃、16/8h光暗周期的培养；

③外植体制备：将步骤②中的种子在无菌条件下去掉种皮、切掉幼叶和上胚轴，保留0.5～2.0cm的下胚轴，用手术刀片对子叶节部位进行创伤处理；

④固体共培养基的制备：向经过121℃高压灭菌15min后的含有B₅大量元素、B₅微量元素、6-BA、IBA、MES、蔗糖、琼脂，PH 5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠，DTT，半胱氨酸，B₅有机成分、乙酰丁香酮AS及苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中；

⑤农杆菌侵染液的制备：将含有外源基因的重组农杆菌悬于含有1/10×B₅大量元素、1/10×B₅微量元素、1×B₅有机成分6-BA1.0mgL^-1、IBA 0.2mg L^-1、MES 3.9g L^-1、蔗糖30g L^-1，乙酰丁香酮AS 200μM，PH 5.4的培养基中，调节菌液浓度到OD₆₀₀≈0.5，室温静置半小时备用；

⑥农杆菌侵染和共培养：将步骤③中的外植体放入100ml三角瓶中，加入步骤⑤制备的农杆菌侵染液中，摇床上80rpm低速转动30分钟后，取出外植体，用灭菌滤纸吸掉多余菌液，摆放到步骤④中固体共培养培养基上，暗培养3～5天；

⑦芽诱导和抗性植株的获得：将步骤⑥中的外植体转移到恢复培养基上培养7天后，转移到带有筛选压的芽诱导培养基上培养14～21天，然后将诱导出抗性芽的外植体转移到芽伸长培养基上进行芽伸长，芽长4～5cm时转移到生根培养基中，获得转化再生植株移栽到花盆中获得转化的抗性植株。

2.根据权利要求1一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于步骤④固体共培养基的制备中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂为α-氨氧基乙酸AOA、放线菌素D、激酶抑制剂K252a其中的一种。

3.根据权利要求2一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于骤④中所述固体共培养基的制备为向经过121℃高压灭菌15min后的含有1/10×B₅大量元素、1/10×B₅微量元素、6-BA1.0mg L^-1、IBA 0.2mg L^-1、MES 3.9g L^-1、蔗糖30g L^-1、琼脂5g L^-1，PH 5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠158mg L^-1，DTT 154mg L^-1，半胱氨酸1g L^-1，1×B₅有机成分，AS 200μM及20～50μmol L^-1α-氨氧基乙酸AOA苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中。