[发明专利]一种测量小于衍射极限距离的光学成像方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种超高分辨率显微成像的方法，特别是一种测量小于衍射极限距离的光学成像方法。

背景技术：

    远场光学成像的分辨率受衍射极限限制，在可见光范围内难以测量小于200nm的距离。提高光学影像的分辨率一直是远场光学显微成像的研究目标之一。能够突破衍射极限的远场光学成像方法被称为远场纳米显微技术。与近场扫描光学显微镜相比，远场方法避免了实体探针对样品的干扰，可以实现无损检测及活细胞检测。

    已经报道的单分子远场纳米成像的技术有如下三种：①利用荧光分子漂白时间的差异，分别确定检测区内各分子的位置，可以实现8nm 的分辨率；②光激活定位显微术（PALM） 法利用某些荧光分子经光激活后在检测波长下发出荧光的性质，交替施加激活光和检测光，大体控制分子发射荧光的顺序；③超分辨随机光重建显微镜（STORM） 以红、绿两种激光，可控、可逆地开关Cy3/Cy5 染料对中的Cy5 荧光，实现20-30nm 的成像分辨率。众所周知，多波长的同时成像（即多色成像）在视觉效果、信息通量等方面均优于单波长成像。与发射单一波长荧光（简称：单色）的单分子纳米成像原理相似，若能从时序上或空间上分别定位发射不同波长荧光（简称：多色）的分子，则可以实现多色单分子间小于衍射极限距离的测量。Nie利用单通道彩色CCD 和双色荧光微球证实了这一方法的可行性，但是该方法的灵敏度尚有待提高，目前做不到单个纳米颗粒和单个分子的水平。  

    现有超分辨显微成像方法，大多仪器复杂，成本高，应用范围有限，需要专业人员操作、分析。单分子和单个纳米粒子水平上的多色超分辨成像尚未实现。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种测量小于衍射极限距离的光学成像方法，解决单分子和单个粒子水平上不能实现多色超分辨成像的问题，填补技术空白。

本发明的目的是这样实现的：以显微镜为成像平台，以成像检测器为记录仪，以有闪烁现象的衍射极限距离内的发光个体为测量对象，以光栅为识别手段，测量10－200纳米距离内的发射不同波长的发光个体之间的距离；光栅对有闪烁现象的不同发光波长的发光个体进行光谱识别，分别超分辨定位；

所述发光个体是荧光分子，量子点，银簇，碳点，发光纳米颗粒；

所述的光栅是透射光栅、反射光栅；

所述发光波长在可见光范围内即300－800纳米；

基于光栅分光的超分辨定位，具体实施方案为：

（1）、构建标尺：选用发射波长不同的红色与绿色量子点（QD）荧光标记物，分别与两条互补的单链DNA连接，形成“单链DNA-量子点（ssDNA-QD）”交联物；将两种颜色的“单链DNA-量子点”交联物混匀，杂交，形成“红色量子点-DNA-绿色量子点（QD_red-DNA-QD_green）”复合物；DNA长度、量子点半径已知，该标尺长度已知；

    （2）、成像装置： 在成像检测器前放置透射光栅，利用透射光栅分光原理，实现不同发射波长的荧光标记物的光谱成像；成像检测器安置在显微镜上；

    （3）、超分辨定位：用成像装置连续拍摄“红色量子点-DNA-绿色量子点”样品，当图片中只有一个一级条纹时，表明此时只有一种颜色的量子点发光，则其零级光斑可用于此发光量子点的超分辨定位；同样，当只出现另一条一级条纹时，另一种量子点亦可超分辨定位；这样即可分别定位两种量子点中心；

    （4）、漂移的校正：在进行分析的图片上选取一单色发光点作为参考点，该参考点中心随时间的变化即为平台漂移，根据不同帧图片中心的移动轨迹来校正光学平台的漂移；然后计算量子点间的距离；

（5）、定位准确性：按照上述1-5步，测量三种不同长度DNA间的不同颜色量子点的距离；用三种不同距离与三种不同碱基对作图，线性回归计算碱基对的距离，考量定位的准确性；所述的三种不同长度分别为15个碱基对15bp；或者为30个碱基对30bp，或者为45个碱基对45bp。