[发明专利]一种体外诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurr1基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种干细胞诱导方法，具体地说是一种体外诱导人脐带间充质干细胞高表达多巴胺能神经元成熟所必须的Nurr1基因的方法。

背景技术

Nurr1基因（Nuclear related factor 1）又称之为NOT/TINUR/RNR-1/HZF-3,作为即早基因产物，属于孤儿核受体超家族。Nurr1蛋白几乎完全集中表达在中枢神经系统内，与神经干细胞向多巴胺能神经元分化及多巴胺能神经元生存和发展关系密切。研究表明，Nurr1蛋白能够通过多种途径激活酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase, TH）启动子，促进TH的表达。此外，还影响多巴胺能神经元代谢，促进中脑多巴胺能神经元前体细胞向多巴胺能神经元分化，并在分化的维持及晚期分化的信号转导中起决定性作用。

帕金森（PD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，发病率仅次于阿尔茨海默病。其基本的病理改变是特异性的中脑黑质多巴胺能神经元的渐进性变性坏死，致使纹状体内多巴胺神经递质减少，引起锥体外系的功能失调，从而产生静止性震颤、肌肉强直等一系列运动障碍症状。目前，临床上尚无有效的治疗PD的方法。理论上讲，细胞移植替代治疗是最为理想的治疗途径。目前，体外获得的多巴胺能神经元多由胚胎干细胞（ESCs）或神经干细胞（NSCs）诱导分化而成。但是伦理学、安全性问题以及细胞来源和数量的有限，在一定程度上都限制了其未来的的临床移植应用。有研究表明，在多因子诱导条件下可将来源更为丰富的间充质干细胞可诱导分化为多巴胺能神经元，但阳性率较低。为了进一步提高阳性率，目前，国内主要采用Nurr1基因修饰间充质干细胞的方法来提高Nurr1基因的表达，使其更易向多巴胺能神经元分化。但对于未来的临床应用，基因修饰方法也存在一定的风险。如何通过非基因修饰的方法使得间充质干细胞自身高表达Nurr1基因，是目前急需解决的重要课题。

此外，国内目前研究向多巴胺能神经元分化的间充质干细胞多来自骨髓、脐血等。与之相比，脐带源的间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSCs）取材更为方便、体外扩增能力更强且免疫原性低。在短时间内即可获得数量充足、安全而且适于移植应用的细胞，是未来临床应用更为理想的种子细胞。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种体外诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurr1基因的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种体外诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurr1基因的方法，在添加了维甲酸 (RA)、环化腺核苷一磷酸 (CAMP)和Sonic Hedgehog(SHH)的DMEM/F-12培养体系中诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurr1基因。

所述的诱导方法，其特征在于：DMEM/F-12培养体系添加的RA为10^-6 M～10^-4 M 、CAMP为0.5 mM～2 mM和SHH为200 ng/mL～750 ng/mL。

所述的诱导方法，其特征在于:上述的培养体系添加的RA的优选量为10^-5M，CAMP的优选量为1 mM和SHH的优选量为500 ng/mL。

具体包括以下步骤：

1）取2～8代人脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80%～90%融合时，吸除培养瓶内原有培养液，取5～10 mL 0.01M磷酸缓冲液PBS轻轻加入T₇₅培养瓶内洗涤，弃去洗液；

2）加入(质量/体积比)0.25%胰蛋白酶-0.01%乙二胺四乙酸EDTA消化液1.0 mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0 mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；

3）加入20 mL 0.01 M PBS反复吹打冲洗，在室温下1000 转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10 mL DMEM/F-12重悬细胞，在T₂₅培养瓶中接种5×10⁵个人脐带间充质干细胞；

4）培养体系为含体积比浓度为5% 胎牛血清，100 u/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM/F-12完全培养液，添加了10^-5 M RA、1 mM CAMP和500 ng/mL SHH，总体积为5 mL/瓶，置37 ?C，5%二氧化碳培养箱中培养2～4天。