[发明专利]一种蜡样芽孢杆菌普鲁兰酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和现代酶工程技术领域，具体涉及一种来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的普鲁兰酶基因，该基因表达的海藻糖合成酶可以用于淀粉制糖中提高淀粉原料的利用率，从而提高生产效率。

背景技术

淀粉是一种天然高分子化合物，也是一种重要的工业原料，广泛存在于植物的根、茎或种子中。天然的淀粉主要由直链淀粉与支链淀粉组成，直链淀粉所占比例较少，约为20％，大部分为支链淀粉，约为80％。从结构上来讲，支链淀粉是一个具有树枝形分支结构的葡聚糖，一般由1000-300,000个葡萄糖单位连接而成，分子量约为100万，有些可达600万。支链淀粉的结构为高支化聚合物，葡萄糖单位通过α-1，4-糖苷键连接成一直链，在直链上又可通过α-1，6-糖苷键形成侧链，在侧链上又会出现另一个分支侧链。主链中每隔6-9个葡萄糖单位就有一个分支，每一个支链平均含有约15-18个葡萄糖残基，平均每24-30个葡萄糖残基中就有一个非还原尾基。工业上应用的大部分淀粉质原料中支链淀粉占总淀粉质量约为70以上，最常用的玉米淀粉中占74％，马铃薯淀粉中占76％，木薯淀粉83％，而糯米淀粉的支链淀粉含量最高达100％。支链淀粉中约含有4～5％的α-1，6-糖苷键，淀粉加工领域的α-淀粉酶和β-淀粉酶和糖化酶等葡萄糖淀粉酶对α-1，4糖苷键的分解非常容易，但对于α-1，6糖苷键的分解很慢，所以α-1，6-糖苷键的存在阻碍淀粉的分解，影响到淀粉的利用率和产品的质量，因此在淀粉加工过程都需要添加脱支酶来加快的淀粉的水解速度和提高淀粉的利用率。

普鲁兰酶(Pullulanase，EC 3.2.1.41)是一种脱支酶，它能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1，6-糖苷键，形成α-1，4糖苷键的直链淀粉，在以淀粉为原料的制糖加工业中，可以显著提高淀粉原料的利用率，降低生产成本和提高产品质量。在淀粉水解过程中，利用普鲁兰酶与α-淀粉酶、糖化酶配合使用，将淀粉彻底降解为葡萄糖对生产高质量的葡萄糖特别是医用葡萄糖时特别重要。在生产麦芽糖生产中用普鲁兰酶将支链淀粉脱支而形成短的直链淀粉片段，有利于β-淀粉酶的作用，减少β-极限糊精的形成，从而提高麦芽糖的含量，所以普鲁兰酶在生产含量在70％的以上的超高麦芽糖浆中极为重要。

1961年Bender和Wallenfels通过产气气杆菌(Aerobacter.aerogenes)发酵获得普鲁兰酶以后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。近年来，国内对普鲁兰酶的研究主要集中在耐酸耐热高产菌株的筛选及基因的克隆与表达。国内食品工业上所用的普鲁兰酶均是从丹麦NOVO进口

普鲁兰酶的来源有很多种，包括产气气杆菌、放线菌、酸假孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、栖热水生菌等。但是这些来源的普鲁兰酶其酶学性质与淀粉工业耐酸(pH4.6)、耐热(75℃)的要求相差较大，因此，目前国内外大多数普鲁兰酶研究工作主要集中在通过各种方法获得优良普鲁兰酶产生菌种上，而短小芽孢杆菌正是研究的热点之一。其中来源于Brevibacillus brevis和Bacillusderamificans的普鲁兰酶已经实现商业化生产。B.brevis普鲁兰酶由经过遗传改良的B.brevis直接发酵生产；B.deramificans的普鲁兰酶则使用地衣芽胞杆菌重组菌进行生产，生产水平在100单位/mL发酵液～400单位/mL发酵液不等。目前国际上普鲁兰酶的工业化生产被丹麦垄断，我国仅局限于实验室研究，且酶活较低，所以开发普鲁兰酶对食品加工领域具有重要的工业价值。

通过检索，还查到有关普鲁兰酶的一些科技文献：中国专利申请201010256287.6公开了一种来源于芽孢杆菌的胞外普鲁兰酶编码基因及其应用，筛选到一株具有普鲁兰分解能力的芽孢杆菌Bacillus sp.042，利用反向PCR技术克隆了普鲁兰酶编码基因pulA042编码区完整序列，序列分析显示该基因编码区全长2571碱基，编码一856个氨基酸残基的多肽链，多肽链N端32个氨基酸残基组成一典型的信号肽，因此基因pulA042编码一种胞外普鲁兰酶。Bacillus sp.042普鲁兰酶基因pulA042的表达产物具有分解普鲁兰和红色普鲁兰的活性，能降解淀粉中α-1，6糖苷键，不降解α-1，4糖苷键，是一种I型普鲁兰酶。利用基因pulA042生产的重组酶在淀粉加工中用于分解淀粉或糊精分子中α-1，6糖苷键。