[发明专利]一种梅花鹿朊蛋白免疫学检测方法

说明书

技术领域

本发明属生物检验检疫领域，通过构建重组蛋白，利用重组蛋白免疫动物制备抗体，建立一种梅花鹿朊蛋白双抗夹心ELISA检测方法。 

背景技术

朊病毒（Prion）是一种由蛋白质组成而不含有核酸等遗传物质的病毒。朊病毒(PrP^sc)是生物体内普遍存在的正常细胞型朊蛋白（PrP^c），当它由于某种原因结构发生变化，在细胞内发生错误折叠并可以抵抗新陈代谢，进而聚集扩增，最后引起细胞死亡，最终引起宿主发生神经退行性病变，导致不可逆转性死亡。 

朊病毒病作为一种新型疾病，由于它病原的特异性，传统的消毒措施不能破坏它的传染性，正常的食物加工过程中不能有效灭活朊病毒，因此该病对食品安全造成巨大威胁。当疯牛病在欧洲爆发时，英法等国屠宰牛群达到100万只以上，造成巨大的经济损失，同时许多人因为使用了病牛肉制品可能在今后的几十年后感染朊病毒病。 

鹿慢性消耗性疾病（Chronic wasting disease,CWD）和疯牛病（BSE），羊痒疫(Scrapy)，人克雅氏病(CJD)一样都属于朊病毒病。鹿慢性消耗性疾病主要感染北美麋鹿、黑尾鹿、白尾鹿等，广泛分布于北美，主要存在于加拿大和美国。近几年，亚洲国家韩国在引进来自加拿大的鹿体内发现朊病毒，后证实病鹿感染鹿慢性消耗性疾病。 

梅花鹿是我国重要经济动物，梅花鹿制品品种丰富，具有较高的药用价值和经济价值。由于PrP^sc可以吸引PrP^c,并将其转化成PrP^sc导致疾病的传播，而且朊蛋白在各个物种中均高度保守，梅花鹿朊蛋白和北美麋鹿、黑尾鹿、白尾鹿氨基酸同源性则高达93%。一旦该病在我国出现，必将对我国的财政收入、食品安全造成巨大的危害。 

当前对于朊病毒病的检测主要是利用PrP^sc抗蛋白酶消化的特点，对动物组织匀浆进行消化前后的对比，既可以判断该病原是否存在。检测手段主要应用Western blot和免疫组化的方法。这两种方法虽然准确度高，但对仪器和环境的要求很高，需要在实验室进行。 

发明内容

本发明提供一种梅花鹿朊蛋白免疫学检测方法，本发明采取的技术方案是包括下列步骤： 

（一）、鼠抗重组朊蛋白PrP^res单克隆抗体的制备如下：

（a）、重组朊蛋白PrP^res的制备：

（1）制备重组朊蛋白PrP^res基因的人工合成引物为：

       FW: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG；

       RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA；

（2）提取梅花鹿总基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的基因，克隆至PMD-18T-Simple载体上，将PrP^res基因片段插入表达载体pET-Trx中构建重组表达质粒，pET-Trx- PrP^res； 将PrP^res基因片段插入表达载体pET-His中构建重组表达质粒，pET-His- PrP^res；

（3）将重组表达质粒pET-Trx- PrP^res和pET-His- PrP^res转入BL21(DE3)中进行表达，得到两种重组融合朊蛋白PrP^res-Trx和PrP^res-His，表达条件为阳性克隆培养物以1%接种于LB培养基（50mg/L抗生素），37℃剧烈摇荡培养至OD600=0.6时加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，220r/min剧烈摇培4h，离心收集菌体，菌体重新PBS悬浮并经超声波裂解，离心分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE分别检测全菌、上清和沉淀，发现PrP^res-Trx和PrP^res-His分别以包涵体的形式大量表达；