[发明专利]一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离方法，具体的说是一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法。

背景技术

玉米青枯病是世界玉米产区普遍发生的一种土传病害。在我国各地的玉米产区也相继发生且比较严重，从而严重影响玉米的产量，一般玉米青枯病的发病率为10%-20%，多雨季节发病严重，最高可达80%以上。一般情况下按病情发展速度和田间症状可分为急性型和普通型。急性型多发生在玉米生长后期乍雨乍晴的天气，又称青枯型，发病速度快，通常在1-2天内全株迅速失水枯萎，似开水烫，呈灰绿色青枯状，茎基部可见维管束已变褐色，最后导致水渍状坏死，果穗下垂。普通型多在连续阴雨的天气发生，又称黄枯型，病情发展较慢，一般在5-10天全株才表现症状，整株叶片自下端开始依次黄枯，有时也呈现水烫状青黄枯，茎基初呈褐色水渍状斑，表皮失水轻微皱缩，进而变软成条纹凹陷，严重者叶片全部黄枯，根坏死，果穗下垂，茎基髓部中空，极易倒伏。

玉米青枯病是一种典型的土传病害，且为多种病菌侵染所致，其病原菌又为多寄主和半腐生性，病原菌在土壤、肥料、病株残体和种子上越冬。目前对于玉米青枯病病原菌的分离尚不完善，没有可行的分离方法。

发明内容

本发明针对上述问题的不足，提供一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，利用分离玉米青枯病原腐霉菌培养基将玉米青枯病原腐霉菌种进行分离，其分离方法简单。

本发明涉及的试剂：DNA凝胶回收试剂盒购买于碧云天生物技术研究所，该试剂盒中自配有成品的DNA纯化结合液，洗涤液，洗脱液，DNA纯化柱，收集管；

本发明为解决上述问题所采用的技术方案是：一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，分离玉米青枯病原腐霉菌所用的分离培养基的原料由琼脂、葡萄糖、马铃薯、酵母浸膏和复合抗生素母液组成，各原料的加入量是：15—30g的琼脂、15—30g的葡萄糖、150—300g的马铃薯、0.8—1.5g的酵母浸膏和0.4—0.7mL的复合抗生素母液；

利用分离培养基分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步骤为：

步骤一、抗生素培养基的配制

1）在浓度为80万U/瓶的青霉素钠中加入无菌去离子水，混合均匀，制得浓度为20万U/mL的母液a，备用；

2）在浓度为100万U/瓶的硫酸链霉素中加入无菌去离子水，混合均匀，制得浓度为20万U/mL的母液b，备用；

3）按重量份数比取1份的浓度为20万U/mL的母液a和1份的浓度为20万U/mL的母液b，混合均匀，制得浓度为10万U/mL的复合抗生素母液，备用；

步骤4）在4000mL的水中加入400-600g的马铃薯，煮30—40分钟，过滤，得到马铃薯滤液，备用；

步骤5）在1500mL的马铃薯滤液中加入15—30g的琼脂、15—30g的葡萄糖和0.8—1.5g的酵母浸膏，加热至80—90℃，使琼脂溶解，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基煮至1000mL时，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶100mL，后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1.05kg/cm²，温度为121℃，灭菌40分钟，取出，后在21℃条件下冷却至60℃止，在每个含有酵母浸膏马铃薯葡萄糖琼脂培养基的三角瓶内加入0.4—0.7mL步骤3）中得到的复合抗生素母液，混合均匀，使每个三角瓶内的抗生素浓度为20U/mL，制得抗生素培养基，后将抗生素培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内抗生素培养基的含量为30mL，放置40分钟，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板，备用；

步骤6）取步骤4）中得到的1000mL马铃薯滤液，在滤液中加入15—30g的琼脂、15—30g的葡萄糖，0.8—1.5g的酵母浸膏，加热至80—90℃，使琼脂溶解，后将溶液定容至1000mL，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶100mL，然后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1.05kg/cm²，温度为121℃，灭菌40分钟，取出，后在21℃条件下冷却至60℃止，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内含有30mL的培养基，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板，备用；

步骤二、病原菌的萌发

1）将含有病原菌的玉米杆，剥离叶片，用保鲜膜将玉米杆包装好并放于10℃条件下，放置3天。