[发明专利]一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体的说是一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法。

背景技术

玉米是全世界总产量最高的粮食作物。玉米青枯病又称玉米茎基腐病、基腐病，是世界玉米的主要病害之一。其危害非常大，相关资料报道，有些国家，由于玉米青枯病造成玉米产量的损失可达25—33%，有的甚至高达50%以上。

玉米青枯病是一种土传病害。由于土壤环境比较复杂，在研究土传病害，分离其病原菌时经常会受到多种因素的干扰，导致病原菌分离和鉴定的困难。在茎部的维管束病害中，当病害可为肉眼所见时，往往己到病害发展的中后期，不同的寄生菌和腐生菌己在发病部位大量繁殖，同样很难通过分离的方法来确定病原菌。通过致病性测定虽然可以鉴别分离物的致病属性，但由于根病和维管束病害所需发病周期长，环境条件不易控制，其它真菌的污染很难排除，因此也不易获得准确的结论。以往在对玉米青枯病病原菌苗期致病性的报道，多集中在研究玉米根部的发病情况，使用土埋法进行检测。由于复杂的土壤环境，再加上清洗根时容易对根部造成损伤，易导致统计上的误差，造成结果不准确，而郭-麦二氏法检测复杂，同时测定结果易不准确。

发明内容

本发明针对上述问题的不足，提供一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，其制备方法简单，操作简便，检测结果准确。

本发明涉及的试剂：DNA凝胶回收试剂盒购买于碧云天生物技术研究所，该试剂盒中自配有成品的DNA纯化结合液，洗涤液，洗脱液，DNA纯化柱，收集管；

本发明中所涉及的玉米青枯病原镰刀菌为一般市售产品，均可由保藏中心或生物公司购买得到；

本发明为解决上述问题所采用的技术方案是：一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，所述的检测方法为：

步骤一、水-琼脂混合培养基的制备

1）在1000mL水中加入17g琼脂，加热使琼脂溶解，后加入1.5g的硝酸钙、1.5g的硝酸钾、1g的磷酸二氢铵和0.5g的硫酸镁，搅拌均匀，形成混合液，分装于300mL三角瓶中，每瓶100mL，丙烯膜封口，并留有排气孔，然后将每一个含有混合液的三角瓶送入高压灭菌锅内，在压强为0.14MPa，温度为121℃，灭菌30分钟，制得营养琼脂培养基，备用；

2）在无菌条件下，将步骤1）中每一个灭菌后的营养琼脂培养基中加入100mL的去离子水，然后将营养琼脂培养基搅碎至粒径为0.5--0.8cm的颗粒时止，混合均匀，形成水-琼脂混合培养基，备用；

步骤二、玉米苗培养

按重量分数比取1份粒径为0.8mm的玉米和2份浓度为0.1%的汞，将玉米在汞中浸泡10分钟，取出，用去离子水洗涤3次，然后将洗涤后的玉米放到底层铺有无菌滤纸的培养容器中，后在培养容器内加入无菌去离子水，去离子水的加入量淹没滤纸时止，后将培养容器送入25℃的培养箱内，培养3-4天待玉米发芽后，将玉米芽移植到水-琼脂混合培养基中，25℃-30℃条件下，见光培养，备用；

步骤三、镰刀菌接种菌液制备与接种

1）在100mL的去离子水中加入20g的马铃薯片，煮20-30分钟，过滤，得到滤液，后在滤液中加入2g的葡萄糖，混合均匀，然后用去离子水定容至100mL止，制得马铃薯液体培养基，备用；

2）在无菌条件下，在马铃薯液体培养基中接入一个玉米青枯病原镰刀菌种，送入摇床上，在25℃条件下，发酵培养培养4-6天，形成玉米青枯病原镰刀菌培养菌液，然后在玉米青枯病原镰刀菌培养菌液中加入磁力搅拌器，转速为150转/分钟，搅拌160-200分钟，使整个菌液呈糊状并能用玻璃吸管定量吸入状态，后继续培养24小时，形成镰刀菌接种菌液，备用；

3）玉米幼苗生长至丙烯膜处，在丙烯膜上开一个玉米生长口，待玉米生长至4-5片叶子时止，在无菌条件下，向培养玉米的三角瓶内加入5-6mL步骤2）中得到的镰刀菌接种菌液，25-30℃条件下，见光培养10天，得到感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米，备用；

步骤四、对感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米进行检测

1）取直径为2cm的感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部，洗净，然后在研钵内加入取1g感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部、0.5mL的TE溶液、0.5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均匀，得到物料，备用；