[发明专利]可用于诱导肝细胞损伤的RNA干扰靶点

说明书

发明领域

本发明主要涉及分子生物学、细胞生物学和实验动物学领域。更具体地，本发明涉及可用于诱导肝细胞损伤的5个RNA干扰(RNAi)靶点以及应用这些靶点的重组表达载体和应用这些靶点以各种方式获得的可用于诱导肝细胞损伤的药物或组合物和方法。

发明背景

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是全世界最重要的公共卫生问题之一。HBV感染引起的相关疾病包括急性或慢性乙型肝炎，及由慢性乙型肝炎进一步发展引发的肝硬化(HC)、肝细胞癌(HCC)等。由于HBV是一种种属特异性和组织特异性极强的DNA病毒，其只感染人和高等灵长类动物，而不感染医学中常用的哺乳类实验动物，因此需要建立一种有效、稳定的HBV感染动物模型以满足目前研究的需要。构建人鼠嵌合HBV感染小鼠模型是一个重要的研究方向。一般而言，构建人鼠嵌合HBV感染小鼠模型的一个必要条件是人肝细胞移植入小鼠肝小叶及实质细胞附近后，必须具备生长优势以竞争过复原能力强的鼠肝细胞，即需要对小鼠肝细胞造成特异性肝损伤。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的细胞内的序列特异性的抑制基因表达的机制，其于1998年在线虫的基因表达抑制研究中被首次提出(Fire A等，自然，1998年，391卷：806-811页)。在此之后，进一步的研究发现，RNAi广泛存在于高等哺乳动物以及真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等几乎所有的真核生物中，是一种普遍存在和保守的抑制基因表达的机制，可起到调控基因表达、抗病毒入侵、抑制转座子活动等作用(Dykxhoorn DM等，自然分子细胞生物学综述，2003年，4卷：457-467页)。目前RNAi的机制已基本被阐明：内源或外源产生的dsRNA分子在细胞质中被称为Dicer的RNA酶III切割成小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。典型的siRNA结构特征为：5′端被磷酸化，3′端对称性突出2-3nt并带羟基，长度为19-23nt的dsRNA。siRNA分子与称为RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducing silencing complex，RISC)的蛋白复合体结合，RISC具有解螺旋酶和核酸内切酶活性。siRNA分子在复合体中被解聚，其中反义链与可与之匹配的靶mRNA按碱基配对原则结合，并引导与之结合的RISC将靶mRNA在与反义链的结合区中部距5′端10nt的位置处酶解，从而抑制靶基因的表达。目前获得siRNA的方法主要有：可表达小发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)的质粒和重组病毒载体、化学合成方法、体外转录等。

目前，RNAi技术已被广泛用于特异性下调基因表达研究。研究显示，延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)是细胞酪氨酸代谢途径的重要水解酶(Grompe，al-Dhalimy et al.1993)。肝细胞中FAH的缺乏会导致酪氨酸分解代谢受阻，无法生成延胡索酸、乙酰乙酸和琥珀酸盐，引起酪氨酸在体内的蓄积，导致肝脏损伤。因此，本发明人提出，通过RNA干扰的方法下调FAH的表达，从而获得诱导肝细胞损伤的效果。由于并非所有符合常规设计要求的RNAi靶点都能够有效抑制靶基因的表达，不同靶点间的抑制效率各有差别，因此，选择合适的具有高抑制效率的RNAi靶点是十分重要的。选择合适的RNAi靶点需要从结构特征、抑制效率、非人类基因同源性等方面进行综合考虑。可使用的辅助方法包括目前已提出的siRNA辅助设计软件、RNA分子结构分析、核酸序列分析比对以及实验经验等，并通过具体的抑制评估实验予以验证。

利用RNA干扰技术可建立有效的诱导肝细胞损伤的方法，然而该方法需要提供可有效下调FAH的表达的RNA干扰靶点。本发明满足了这一要求，提供了可用于该目的的RNA干扰靶点、重组表达载体等。

发明内容

本发明提供了靶向FAH的RNA干扰靶点，可表达靶向本发明所述的RNA干扰靶点的siRNA的表达质粒、重组病毒载体和细胞，以及包含靶向本发明所述的RNA干扰靶点的siRNA的药物或组合物。

本发明提供的RNA干扰靶点可用于靶向FAH，抑制FAH基因表达。本发明提供的RNA干扰靶点是通过以下方法获得的：选择和设计可靶向FAH的RNA干扰靶点序列；通过设计合适的寡核苷酸构建siRNA，并将其克隆入表达载体以获得相应的siRNA表达质粒；将该质粒与带有FAH基因的报告质粒进行共转染，并通过检测报告基因的表达水平来筛选获得合适的RNA干扰靶点。