[发明专利]重组融合毒素VEGF165-melittin及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin，其特征在于是通过连接肽在蜂毒素短肽melittin的氨基端连接VEGF₁₆₅得到，或通过连接肽在VEGF₁₆₅的氨基端连接蜂毒素短肽melittin得到；所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1或2所述重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin的编码基因。

4.根据权利要求3所述重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin的编码基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.权利要求1或2所述重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于是由权利要求3所述重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin的编码基因插入出发载体的多克隆位点得到，所述出发载体为pPICZa，pPIC9或pHIL-sl。

7.含有权利要求5所述表达载体的转基因细胞系。

8.含有权利要求5所述表达载体的宿主菌。

9.一种重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）以SEQ ID NO:4~5为引物，扩增VEGF₁₆₅基因；

（2）合成蜂毒素短肽melittin基因，两端分别连接限制性酶切位点EcoRI和XbaI，连接到载体pPICZα的多克隆位点，得到重组载体；

（3）分别用EcoRI和XhoI对VEGF₁₆₅基因和重组载体进行双酶切，酶切产物连接后，电穿孔法转化宿主毕赤酵母菌，构建VEGF₁₆₅-Melittin基因工程菌；

（4）培养VEGF₁₆₅-Melittin基因工程菌，培养基为BMGY培养基，28℃下培养，诱导其产生可溶性重组融合蛋白VEGF₁₆₅-Melittin；

（5）将步骤（4）的培养物离心、收集上清，进行亲和柱层析纯化VEGF₁₆₅-Melittin蛋白，柱层析所述填料为Ni-NTA树脂，吸附条件为pH 5.5~8.5之间，洗脱条件为降低pH、逐步提高咪唑的浓度或加入EDTA或者EGTA，pH在4~6之间，咪唑浓度为0.02~0.5M；

（6）采用分子量1000道尔顿的超滤膜超滤，采用半透膜透析，透析液为10mM Tris·HCl和150mM NaCl、冻干得到VEGF₁₆₅-Melittin蛋白。

10.权利要求1或2所述重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。