[发明专利]一种基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒

权利要求书

1.一种基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，其特征在于包括下列部件：

（1）探针耦联编码微球A液，1管，内装6种不同微球分别耦联六种病毒探针；

（2）B液，1管，内装1.5×氯化四甲铵；

（3）C液，1管，内装1×氯化四甲铵；

（4）D液，1管，内装1×TE，pH 8.0；

（5）E液，1管，内装链酶亲和素-藻红蛋白；

（6）F液，引物，6管，分别装有六种病毒特异性引物，其中下游引物5'末端经biotin修饰；

（7）阳性对照G液，6管，分别装有六种病毒标准株基因组DNA阳性模板；

（8）96孔滤模板，1张。

2.根据权利要求1所述的基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，其特征在于六种病毒探针及引物是根据各自基因保守区序列设计的，探针的5'末端用H₂N-C12标记，其DNA序列分别如下：

探针序列（5'-3'）：

HSV-I：TCCGTGTTCACCACGAGTACCTGCGTCACC

HSV-II：CGCGCTTATGGACACACCACACGACAACAA

Epstein-Barr：CGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGA

EV71：CATCATCAAATGCTAGTGACGAGAG

CA16：GATGCCAACACGGTGTAGTAGGAATTGTCT

ECHO：CTATGATGGATGGTCTCACTTCAGTCAGAG

引物序列（5'-3'）：

HSV-I：上游引物—GCCGTTGAGCTAGCCAGCGA

下游引物—GTGCTGGTGCTGGACGACAC-biotin

HSV-II： 上游引物—GTAAGCGCGGGCCAAAGGAT

下游引物—TCAAACACGGAAGCCCGAAC –biotin

Epstein-Barr：上游引物—CCTGCCAAAGAGCCAGATCTAAG

下游引物—AGCCAACCATAGACCCGCTTCCT –biotin

EV71：上游引物—GAGCCCTCACTCATGCTCTAC

下游引物—AGTTGTGCCTTCAAGAGGGAG –biotin

CA16：上游引物—CCTACAGCTGCCAACACTGAA

下游引物—ACCATCCGTGTTCTGTGTACC–biotin

ECHO：上游引物—CCAGGATGTCGATACCATTCATGAG

下游引物—TCACCCCTTGCACATCAAAGTTGAC–biotin。

3.权利要求1所述的基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒的使用方法，按下列步骤进行：

(1) 病毒基因组DNA或RNA提取，RNA需逆转录为cDNA；

(2) 设计五种病毒引物，下游引物5'末端用Biotin修饰，进行PCR扩增产物；

PCR扩增反应体系包括：10×Multi Hotstart Buffer、超纯dNTP、DNA Polymerase、上游引物、下游引物、基因组DNA模板、UDG、dUTP、ddH₂O；

按下列条件扩增：

95°C 10 min预变性，→94°C 30 sec 35个循环  →72°C 10 min →4°C保存

                                       57°C 90 sec

                                       72°C 60 sec；

(3) 杂交检测

A、准备探针微球混合工作液：用1.5×TMAC杂交液B液使探针微球A液的浓度稀释为每种微球150个/μl，震荡混匀；

B、分别向样本管、阳性对照管、阴性对照管和空白管加入33μl探针微球混合工作液；

C、向各样本管、阳性对照管和阴性对照管依次对应加入5μl已生物素化的PCR产物，空白管加入5μl ddH₂O，然后向各反应管补加pH 8.0的TE buffer D液，使反应总体积为50μl；

D、将各反应管置于PCR仪，设置反应条件，95°C 5 min，55°C 15 min；

E、在第4步同时，用C液1×TMAC配制新鲜的3μg/ml 的SA-PE，震荡混匀；

F、将第4步中的反应液转移入预湿的96孔滤模板孔内，负压真空抽滤除去上清，依次向每孔加入100 μl 3μg/ml 的SA-PE，震荡混匀，室温避光孵育10min；迅速将96孔滤模板转移至Luminex200液相芯片检测仪内，设置杂交温度后进行检测；检测样本的荧光信号值大于四倍阴性对照荧光信号值则为阳性，反之视为阴性。