[发明专利]一种检测铜离子的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测铜离子的酶联免疫试剂盒，同时还涉及一种该试验盒在检测样品中铜离子含量方面的应用，属于酶联免疫检测领域。

背景技术

铜在土壤中和农作物中积累，会污染粮食籽粒，进而铜在农畜等产品中有不同程度的残留，造成农畜产品中铜污染超标，严重影响我国农畜产品质量和国际竞争力，而且还严重危害人类的身体健康。因此，世界各国都十分重视环境和农产品重金属污染的控制和监测。传统的重金属铜检测方法如：原子吸收光谱分析、电感耦合等离子发射光谱分析等需要大型的昂贵的分析仪器，无法用于现场检测，难以适应环境及农畜产品的现场抽查及产品进出口快速通关的要求。因此，需要发明一种新的重金属铜检测方法以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测铜离子的酶联免疫试剂盒。

同时，本发明的目的还提供了一种试验盒在检测样品中铜离子含量方面的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种快速检测铜离子的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括：铜离子特异性抗体、铜离子-载体蛋白偶联物和酶标二抗，其中铜离子特异性抗体为鼠抗铜离子的单克隆抗体，可用铜离子与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如鼠)制得。

所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清蛋白或人血清白蛋白等常用载体蛋白。

所述铜离子与载体蛋白的偶联物可通过将铜离子与双功能螯合剂螯合后再与载体蛋白采用化学方法偶联得到。

所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

所述酶标二抗可以用商品化的辣根过氧化物酶酶标二抗，也可以通过过碘酸钠法或戊二醛法将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酸酶与二抗偶联制得。

在本发明的一个优选实施方案中，所述酶标二抗为羊抗鼠IgG抗体。

用于制备所述酶标板的固相材料，包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯；载体的形式是微量反应板凹孔。

为了方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括铜离子抗原或抗铜离子特异性抗体的酶标板、铜离子标准溶液、显色剂、洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。

所述的洗涤液为0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。

所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为1∶1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脉，显色剂B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。

所述的浓缩样品稀释液为含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

所述当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1-2mol硫酸；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为对硝基苯磷酸缓冲液，终止液为1-2mol/L氢氧化钠溶液。

所用的封闭液含有10％兔血清，0.1‰叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释0.05-0.1μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，再4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200川封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

另一方面，本发明还提供了一种检测水、牛奶等样品中铜离子含量的方法，包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用、试剂盒进行检测，向包被有铜离子抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗铜离子多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终上，用酶标仪测定吸光度值；

(3)分析检测结果。

本发明中抗原的合成过程为：

1.铜离子完全抗原的制备

将铜离子先与双功能螯合剂通过羧基发生螯合，再与载体蛋白反应，通过硫脲基偶联得到完全抗原。

铜离子是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须先与双功能螯合剂通过羧基发生螯合再与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。

2.铜离子鼠单克隆抗体的制备

动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以铜离子与载体蛋白偶联物为免疫原，得到较好的多克隆抗体，取出脾脏进行细胞融合。

细胞融合与克隆化：取免疫BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。