[发明专利]血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌Apx I C/Apx II C双基因缺失疫苗候选株

说明书

技术领域

本发明涉及一株无药物抗性标记的血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌Apx I C/Apx II C双基因缺失疫苗候选株，属于动物细菌基因工程及兽医生物制品领域。 

背景技术

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的一种猪的高度传染性和致死性呼吸道疾病。广泛存在于全世界所有的养猪国家，尤以欧美各国流行严重，给养猪业造成了巨大的经济损失，严重地阻碍了世界养猪业的健康发展。由于胸膜肺炎放线杆菌血清型众多，且各个国家及地区流行的优势血清型各不相同，给该病的防制带来了极大的困难。目前该病在我国发病率仍逐年增长，有的猪场阳性率已达到70％以上，已经成为集约化猪场的主要传染病之一，严重危害到我国的养猪业。 

胸膜肺炎放线杆菌于1957年由Pattison等首次报道，最早分离于1961年，随后在1963年和1964年相继报道了该病原菌的分离，1990年我国的杨旭夫首次正式确认了国内大型集约化养猪场存在PCP，同时分离出致病菌株并确定了血清型。猪胸膜肺炎放线杆菌属于巴氏杆菌科，放线杆菌属，为革兰氏阴性多形态小球杆菌，兼性厌氧，有荚膜和菌毛，不形成芽抱，能产生4种RTX毒素。新鲜病料中的APP呈两极染色。多数菌株在绵羊鲜血平板上呈β溶血，它在金黄色葡萄球菌划线两侧，产生一种宽的加重溶血区(cAMP)和“卫星”现象。本菌需要的营养条件必须丰富，否则即使加入NAD也生长不出典型菌落，但经多次传代后在LB培养基上也能生长。APP专性寄生于猪的呼吸道，但也有从羔羊体内分离到的报道。 

APP是一种多毒力因子病原，如动物机体的免疫状况、病原的数量、病原的毒力因子及外界环境的影响等，其中病原的毒力因子在疾病的发生、发展过程中 起着举足轻重的作用。多年来，毒力因子与致病力之间的关系亦是国内外学者最为关注的问题，Bosse等(2002)详细地阐述APP感染的病理学及致病机理。APP的毒力因子主要包括溶血外毒素、荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶、脲酶等，其中溶血外毒素是引起猪发病最重要的毒力因子。 

溶血外毒素也称为Apx毒素。APP产生的溶血外毒素(Apx)被认为是APP最重要的一个毒力因子。Devenish等(1990)研究发现Apx也是一种重要的免疫原，Apx刺激机体产生的抗体水平和保护力呈正相关。全部15个APP血清型中共分泌4种Apx毒素，分别为Apx I、Apx II、Apx III和Apx IV，四者都属于细胞孔形成毒素。前3种Apx毒素既是APP致病的主要毒力因子，又是APP主要的保护性抗原。Jansen R等(1995)发现不分泌或缺失Apx的APP菌株对小鼠和猪均不致病，缺失株补充了Apx的结构基因和分泌基因后可恢复原来的毒力，而且气管灌注可以直接引起动物的临诊症状和肺部病变。感染耐过猪可以抵抗其他血清型的再次感染，许多能产生毒素的弱毒活苗都具有交叉保护力，均是由于Apx毒素能诱导机体产生抗毒素的抗体。 

Apx I由Apx I操纵子编码，该操纵子包Apx I C、Apx I A、Apx I B、Apx I D 4个基因，A基因编码无活性的前体结构蛋白，C基因编码毒素激活蛋白，负责对毒素进行酰基化激活，B、D基因的翻译后蛋白产物形成跨膜通道，负责毒素由细胞内到细胞外的分泌。Apx I C、Apx I A、Apx I B、Apx I D基因的核甘酸序列在各种血清型中有高度相似性。Apx II由Apx II操纵子所编码，该操纵子仅包括结构基因Apx II A和激活基因Apx I C，而无分泌基因。Apx III由Apx III操纵子所编码，与Apx I一样具有完整的操纵子。Apx III虽然没有溶血活性，但与Apx I和Apx II一样，都具有协同溶血活性。Apx IV毒素Apx IV毒素是近几年在研究猪胸膜肺炎放线杆菌分泌的毒素中发现的，它在整个致病过程中的作用尚不清楚，因为缺少Apx I、Apx II，Apx III但仍能产生Apx IV的菌株不能引起病变或发病。研究表明，所有血清型的APP在体内均可产生Apx IV毒素。