[发明专利]鉴定紫花苜蓿种子真伪的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种鉴定紫花苜蓿种子真伪的专用引物，其特征包括：

第一组紫花苜蓿专用引物：MsITS-F(5′-3′)：TTTTTGAACGCAAGTTGCGC，

                        MsITS-R(5′-3′)：CAACCAACCACGAGACAGA；

第二组草木樨专用引物：MoITS-F(5′-3′)：TTGGCCTCCCGTGAGCTCTATT，

                      MoITS-R(5′-3′)：CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGC。

2.一种鉴定紫花苜蓿种子真伪的试剂盒，其特征包括：

第一组：紫花苜蓿PCR检测体系，其中包括2×PCR Master10μl，为3mM MgCl₂，0.2mMdNTP，0.1U/μl Taq和2×PCR Buffer；引物MsITS-F：TTTTTGAACGCAAGTTGCGC 1μl，引物MsITS-R：CAACCAACCACGAGACAGA 1μl，以及ddH₂O 7μl；

第二组：草木樨PCR检测体系，其中包括2×PCR Master10μl，为3mM MgCl₂，0.2mMdNTP，0.1U/μl Taq和2×PCR Buffer；引物MoITS-F：TTGGCCTCCCGTGAGCTCTATT 1μl，引物MoITS-R：CTTTTCCTCCGCTTATTGATATGC 1μl，以及ddH₂O 7μl。

3.一种鉴定紫花苜蓿种子真伪的方法，其特征包括如下步骤：

A.收集种子，采用双层滤纸萌发法，20℃萌发72小时，提取萌发种子基因组DNA备用；

B.利用第一组紫花苜蓿专用引物，对种子基因组DNA进行PCR检测；PCR检测体系总体积为20μl，其中包括2×PCR Master10μl，为3mM MgCl₂，0.2mM dNTP，0.1U/μl Taq和2×PCR Buffer；DNA模板，浓度为200ng/μl 1μl；引物MsITS-F，浓度为10nM 1μl，引物MsITS-R，浓度为10nM 1μl，以及ddH₂O 7μl；PCR扩增条件为：(1)95℃预变性2分钟；(2)95℃变性30秒；(3)61℃退火30秒；(4)72℃延伸30秒；(5)第2～4步骤循环30次；(6)72℃延伸5分钟；

C.利用第二组草木樨专用引物，对种子基因组DNA进行PCR检测；PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×PCR Master10μl，为3mM MgCl₂，0.2mM dNTP，0.1U/μl Taq和2×PCR Buffer；DNA模板，浓度为200ng/μl 1μl；引物MoITS-F浓度为10nM 1μl，引物MoITS-R浓度为10nM 1μl，以及ddH₂O 7μl；PCR扩增条件为：(1)95℃预变性2分钟；(2)95℃变性30秒；(3)70℃退火30秒；(4)72℃延伸30秒；(5)第2～4步骤循环10次，从第二个循环开始每循环一次退火温度降低0.5℃；(6)95℃变性30秒；(7)65℃退火30秒；(8)72℃延伸30秒；(9)第6～8步骤循环20次；(10)72℃延伸5分钟。

4.一种鉴定紫花苜蓿干草真伪的方法，其特征包括如下步骤：

A.选择干草，提取基因组DNA备用；

B.利用第一组紫花苜蓿专用引物对干草基因组DNA进行PCR检测；PCR检测体系总体积为20μl，其中包括2×PCR Master10μl，为3mM MgCl₂，0.2mM dNTP，0.1U/μl Taq和2×PCR Buffer；DNA模板浓度为200ng/μl 1μl；引物MsITS-F浓度为10nM 1μl，引物MsITS-R浓度为10nM 1μl，以及ddH₂O 7μl；PCR扩增条件为：(1)95℃预变性2分钟；(2)95℃变性30秒；(3)61℃退火30秒；(4)72℃延伸30秒；(5)第2～4步骤循环30次；(6)72℃延伸5分钟；

C.利用第二组草木樨专用引物对干草基因组DNA进行PCR检测；PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×PCR Master10μl，为3mM MgCl₂，0.2mM dNTP，0.1U/μl Taq和2×PCR Buffer；DNA模板浓度为200ng/μl 1μl，引物MoITS-F浓度为10nM 1μl，引物MoITS-R浓度为10nM 1μl，以及ddH₂O 7μl；PCR扩增条件为：(1)95℃预变性2分钟；(2)95℃变性30秒；(3)70℃退火30秒；(4)72℃延伸30秒；(5)第2～4步骤循环10次，从第二个循环开始每循环一次退火温度降低0.5℃；(6)95℃变性30秒；(7)65℃退火30秒；(8)72℃延伸30秒；(9)第6～8步骤循环20次；(10)72℃延伸5分钟。