[发明专利]利用量子点检测转基因水稻中Bt蛋白的方法

权利要求书

1.一种检测转基因水稻中CrylAb蛋白的快速简便方法，其特在于如下步骤：

(1)抗CrylAb单克隆抗体的制备

以CrylAb蛋白为抗原获得兔血清，通过纯化得到抗CrylAb单克隆抗体作为一抗，分泌该单克隆抗体的抗CrylAb单克隆抗体杂交瘤细胞HHX-001保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CTCC NO：C201214。

(2)CdSe/ZnS量子点标记的羊抗免IgG抗体(即二抗)的制备

1)将500μL羊抗免IgG抗体溶液分装成10等份的50μL小管子，保存于-20℃冰箱内，待用时取出一小管，置于4℃冰箱处，备用；

2)取25μL CdSe/ZnS量子点母液，20μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)端二亚胺盐酸盐溶液和10μLN-羟基琥珀酰亚胺溶液，pH7.0，混合反应5min，再加入0.2mg羊抗免IgG抗体溶液，加无菌水配成100μL的标记物溶液，在常温下反应2-4h；将上述标记物溶液置磁力搅拌器中混匀，反应结束后置于4℃冰箱内过夜，得到CdSe/ZnS量子点标记的羊抗免IgG抗体粗品；

3)将CdSe/ZnS量子点标记的羊抗免IgG抗体粗品100μL用加样枪放入含有超滤膜的样品储存管中，在另一个管子中放入等量的水作为平衡，在转速为10,000rpm，离心时间为20min，离心温度为4℃的离心机中离心；

4)在步骤3)离心结束后，加入PBS缓冲液，按步骤3)的条件重复离心一次；

5)在步骤4)离心结束后，向样品储存管中加入100μL PBS缓冲液，然后将其倒扣在离心管上，在转速为500rpm，时间为3min，温度为4℃的离心机中离心并回收样品，即为二抗；

(3)CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心的制备

以抗CrylAb单克隆抗体为一抗，将该一抗与包被缓冲液按体积比1∶1000稀释，然后加入到酶标板孔中，20℃孵育过夜，次日用PBS缓冲液洗板3次，每次5min，拍干后加封闭缓冲液，每孔200μL，于37℃下静置1h，之后用PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；将CrylAb蛋白溶液用PBS缓冲液稀释至6.0pg/ml、12.5pg/ml、25.0pg/ml、50.0pg/ml、100.0pg/ml、200.0pg/ml梯度浓度后加于包被孔中，每孔100μL，于37℃下静置1h，之后用PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；将纯化后的二抗用PBS缓冲液稀释至10.00ug/mL，加入酶标板的包被孔内.每孔100μL，于37℃下静置1h，之后用PBS缓冲液快速洗涤，得到CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心；

(4)绘制CrylAb蛋白的标准曲线

将0.4μg/ml的CrylAb蛋白标准溶液稀释为200pg/mL、100，pg/mL、50，pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL和6pg/mL梯度浓度，用CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心检测水稻CrylAb蛋白的含量，以该梯度浓度稀释的CrylAb蛋白溶液浓度为自变量，以对应的CrylAb蛋白相对荧光强度值减去空白对照相对荧光强度值为应变量，绘制标准曲线，公式如下：

Y＝0.0137X+0.02    R²＝0.994，

X为系列梯度稀释的CrylAb蛋白溶液浓度为自变量，

Y为对应CrylAb蛋白相对荧光强度；

(5)用酶标仪检测OD₄₅₀的值，判定待检测水稻中CrylAb蛋白的含量；

其中：

所述的CdSe/ZnS量子点母液的组分及配制：

称取0.0127g，0.1mmol的CdO和0.11g的硬脂酸放入50mL的三颈瓶中，在氩气保护下，加热至130℃，使CdO充分溶解于硬脂酸中；将温度降至室温后，称取三辛基氧化磷和十六烷基胺各1.5g放入三颈瓶中，搅拌加热到230℃，另称取0.032g，1mmol的硫粉，在氩气保护下，使之溶解于2mL三辛基磷中，抽入5mL的针管中作为储备液；当Cd前驱物温度达到230℃时，将Se粉储备液快速注入三颈瓶后，使温度降至180℃，保持10min，收集CdSe样品溶于氯仿中备用；

称取0.632g的硬脂酸锌和0.032g的硫粉分别加入2mL的十八碳烯中加热至120℃充分溶解，分别得到硬脂酸锌溶液和硫粉溶液，降温至70℃，将硬脂酸锌溶液和硫粉溶液混合后于70℃下保存备用；将分散于氯仿中的CdSe样品加入瓶中，加热至120℃保持30min，蒸干氯仿，升温至200℃；抽取硬脂酸锌和硫粉的十八碳烯溶液，以0.2mL/min注入ZnS壳层，注入完成后，升温至230℃保持1h，降温至60℃，反应产物用甲醇沉化，离心清洗三次，得到CdSe/ZnS氯仿溶液；取CdSe/ZnS氯仿溶液、巯基丙酸和去离子水各1mL放入瓶中混合，强烈搅拌3h，抽取上层水溶液，加甲醇离心清洗三次，后分散于1mL去离子水中即获得CdSe/ZnS量子点母液；

其中：

PBS缓冲液组分及配制：

KH₂PO₄ 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 2.9g，Tween-20 0.5mL，加蒸馏水定容至1L，调pH至7.4；

包被缓冲液组分及配制：

Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加蒸馏水定容至1L；

封闭缓冲液组分及配制：

将牛血清白蛋白0.1g溶于100mL PBS缓冲液中。