[发明专利]一种荧光定量RT-PCR检测丙型肝炎病毒的试剂盒

权利要求书

1.一种荧光定量RT-PCR检测丙型肝炎病毒的试剂盒，试剂盒包括：(1)核酸提取试剂、HCV反应液A、HCV反应液B、HCV反应液C、HCV内标溶液、阴性质控品、HCV强阳性质控品、HCV临界阳性质控品、HCV阳性定量参考品1-4，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR反应体系包括HCV反应液A、HCV反应液B和HCV反应液C，其特征在于HCV反应液A(引物探针混合液)中正向和反向引物分别是：

5’-CATGGCGTTAGTAYGAGTGTCG-3’(SEQ ID NO：1)

5’-TCCYGGCAATTCCGGTGTAC-3’(SEQ ID NO：2)；

HCV反应液A寡核苷酸探针是5’-X-TCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCG-Y-3’(SEQ ID NO：3)，其中X/Y表示荧光标记基团，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针；

HCV反应液A中寡核苷酸探针是5’-X-TCCACGGCAACTCTAGTCGCCCTGC-Y-3’(SEQ ID NO：4)，其中X/Y表示荧光标记基团，包括能够与内标多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于正、反向引物的浓度均为10pmol/人份，目的寡核苷酸探针、内标寡核苷酸探针的浓度均为5pmol/人份。

3.根据权利要求1的试剂盒，HCV反应液B由逆转录酶(c-MMLV酶)、热启动Taq酶、RNasin、dNTPs、酶稀释液组成，其中c-MMLV酶用量为1.5～3.5U/人份、热启动Taq酶用量为3～7U/人份、RNasin用量为15～25U/人份、dNTPs浓度为0.20mmol/L，酶稀释液为一般市售的酶系稀释液。

4.根据权利要求1的试剂盒，HCV反应液C包括一步法RT-PCR反应缓冲液和DEPC水，其中一步法RT-PCR反应缓冲液包含10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、50mmol/L KCl、3.0mmol/LMgCl₂。

5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的最佳反应温度和时间为：50℃逆转录15min，1个循环；95℃ 15min，1个循环；最后94℃ 15s，55℃ 45s，45个循环收集荧光信号。

6.根根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阴性质控品为阴性血浆，HCV强阳性质控品和HCV临界阳性质控品均为含有HCV目的片段的病毒样颗粒，且浓度分别为5.0×10⁶和5.0×10³IU/ml；HCV阳性定量参考品1-4均为含有HCV目的片段的重组质粒，浓度为1.0×10⁴-1.0×10⁷IU/ml；质粒和病毒样颗粒均由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

7.根根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于试剂盒的待检样品是血清或血浆等样品。